А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 54
Текст из файла (страница 54)
Следует контролировать уровень пенообразования н перемешивая прн обработке, поскольку интенсивное ценообразование вызывает денатурацню белков в образующихся тонких пленках на разделе фаз жидкость/газ. Внутренние структуры клеток при этом также подвержены разрушению. Внешний вид отечественного ультразвукового дезинтсгратора УЗДН-1 приведен на рис. 13.1.
При подготовке прибора к работе излучатель ультразвуковых колебаний присоединшот к соответствующему гнезду прибора. Кончик пестика излучателя должен быть опушен в обрабатываемую суспензию на глубину 1 — 2 см. Перед началом обработки излучатель должен быль настроен в резонанс при выбранной мощности на порции подвергаемой обработке пробы или другой сходной по вязкости суспензии в сосуде, используемой для озвучивания. Обычно обработку проводят в пластиковых (полиэтиленовых) центрифужных стаканах, но можно использовать стеклянные стаканы или стаканы из нержавеющей стали.
Необходимым условием является строгий контроль за нагревом излучателя и тсмпературой материала. Излучатель охлаждают холодной проточной водопроводной водой„а пробу — в воде со льдом. Имеется три типа излучателей; на 15, 22 и 35 кГц. Для разрушения бактерий чаще всего используют излучатель на 22 кГц, к которому необходимо подвести для охлажде- 184 ния воду от водопровода (вход — снизу, слив — сверху). Прибор включают в сеть.
После 5-минутного прогрена включают анодное напряжение и ручкой «Анодный ток» устанавливают на шкале амперметра ток Я"'"Я желаемой величины (обычно 0,7 А). Датее ручкой «Резонатор» вводят прибор в резонанс, что можно проконтролировать по резкому возрастанию уровня звука и минимальному значению тока. При выбранном значении облучают суспензию клеток (1 г сырой биомассы и 5 мл среды разрушения) последовательно 6 — 10 раз с интервалами' 50 с при Рис. 13.1.
Схема УльтРазвУкового дезинтегратора УЗДН-1 (справа — панель управления): чатсля и суспензии в воде со льдом. 1 — туыблеР н лампочка общего включения прибора; Разрушенные клетки затем осажда- л тумблер и лампочка включения анодного напряют на скоростной центрифуге (при- женил 3 — Ручка и шкала мощности прибора; 4— ручка выбора частоты излучения; 5 — ручка подстрот«ы мерно 20 тыс.
я в течение 10 — 15 мин ки Разонансной частоты; 6 — выхолной разъем; 7— при 4'С) и надосадочную жидкость излучатель л-- патрубки входа и выхода охлаждающей используют лля определения фер- воды; Р— шнур подключения излучателя к выхолвоментативных активностей. ЗГ яслях му разъему прибора; 10 — апатия крепления иззу »пела безопасности при.облучении суспсизии ультразвуком прибор долзкеп быть заключен в кожух! Описанным методом можно разрушать многие грамположнгельные бактерии, но клетки актиномицстов, дрожжей и других грибов таким методом разрушаются с трудом.
Иногда для усиления эффекта ультразвуковой обработки к суспензии клеток добавляют кварцевый песок, стеклянные бусы малого диаметра или пудру окиси алюминия. 13.1.4. Разрушение клеток с помощью пресса Френч-пресс. Ячейка Френч-пресса предназначена для разрушения микроорганизмов, основанного на перепаде давления в пробе от высокого (550— 1400 ати) до атмосферного, Быстрое изменение давления взрывает клетки изнутри и таким образом разрушает их. Метод наиболее применим к суспензиям объемами от 10 до 30 мл; разрушение меньших объемов сложно технически, а болыпих — занимает много времени.
Время, требуемое для разрушения одной порции клеток неболыпого объема, обычно не превышает 10 — 15 мин. В перерывах необходимо тщательно промывать ячейку от предыдущей пробы и постоянно контролировать состояние полиэтиленового шарика, регулирующего на ячейке степень перепада давления. Перед разрушением клеточную пасту смешивают с буферным раствором в соотношении от 1: 1 до 1: 4 г/мл. Суспензию помещают в ячейку и ставят в гидравлический пресс.
Медленным открыванием клапана успшавливают требуелзую скорость вытекания разрушенного гомогената (обычно 1 капля/с). Для некоторых микроорганизмов необходима двойная или даже тройная обработка, чтобы достичь необходимой степени разрушения. Ячейку перед заполнением суспензией охлаждают в ледяной воде. Степень разрузпсния контролируют микроскопированием или по увеличению вязкости жидкости (в результате выхода ДИК). 185 Рис. 13.2. Пресс для декомпрессионного разрушения клеток: 1 — поршень цилиндра; 2 — цилиндр с отверстием для поршне; 3 — нижняя часть пресса с приемнььм стаканом лля разрушенных клеток; 4 — отверстие для выхода клеток Х-пресс.
Разрушение клеток с применением Х-пресса осно- С .з вано на том же принципе, что и на Френч-прессе, за исключе- 2 нием состояния разрушаемой суспензии. Перед разрушением приготовленную суспензию клеток в буфере замораживают в ячейке (рис. 13.2) при — 70 'С и затем продавливают через тон- 4 кую фильеру с помощью гидравлической системы. Микроорганизмы при этом подвергаются перепаду давления от 500 до 1000 ати и дополнительно абразивному действию кристалликов льла внутри клеток. Под действием давления (обычно это — усилие до 20 т на шкале гидравлического пресса) происходит и и постепенно разогрев замороженного образца.
Когда температу- С ) ра суспензии поднимается до -1Π— 15 'С, начинается продавливание пробы через фильеру. На этом этапе для максимального разрушения необходимо поддерживать лавление по манометру на уровне 10 — 15 т. О конце процесса судят по степени вхождения поршня в ячейку. После продавливания всей порции клеток (поршень входит в верхнюю часть стакана до риски) давление сбрасывают, отделяют верхнюю часть стакана от нижней и размораживают разрушенные клетки. Гомогенат центрифугируют при 20 тыс. я в течение 1Π— 15 мин при 4 Слля осаждения неразрушенных клеток и их крупных обломков.
Этим методом можно разрушить за один прием до 10 г сырых клеток (количество зависит от размеров ячейки для разрушения). Метод неудобен для многократного разрушения клеток, поскольку приходится замораживать и оттаивать ячейку. Обычно время разрушения одной пробы не превьппает 15 — 20 мин. По степени устойчивости к механическому разрушению на прессе клетки микрборганизмов можно выстроить в следууощий ряд: лрожжи > мицелиальные грибы > грамположительные кокки > грамположительные палочки > грамотрицательные палочки > галобактерии > микоплазмы. Данный метод разрушения по степени сто действия на клетку наиболее эффективен и позволяет разрушить даже клетки дрожжей.
13.2. ИЗУЧЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ МИКРООРГАНИЗМОВ По характеру связи с протоплазменными структурами различают энда- и экзоферменты, или внутри- и внеклеточныс. Для полной характеристики ферментной системы микроорганизма определяют ферменты в биомассе и культу- ральной жидкости. Однако следует иметь в виду, что в среде могут находиться нс только экзоферменты, но также эндоферменты, высвободившиеся в результате лизиса отмерших клеток. Для выделения высокоактивных препаратов ферментов необходимо знать условия культивирования микроорганизма, оптимальные для биосинтеза н активности желас- 186 мого фермента.
В случае объектов с неизученной физиолопзей лучше брать активно растущие кулшуры, клетки которых богаче ферментами, а их состав разнообразней. Для определения экзоферментов получают культуральную жидкость, осаждая клетки центрифугированием при 5 — 10 тыс.
я в течение 10 — 30 мнн. Режим центрифугнровання варьируют в зависимости от микрооршнизма. В целях выделения эндоферменгов оиомассу разрушают одним из описанных ранее способов (см. 13.1), затем получают грубые, или бесклеточные, экстракты осаждением неразрушенных клеток (18 тыс. 8, 30 мин, 4 С).
В случае необходимости бесклеточные экстракты подвергают дальнейшему фракционнрованню на растворимую и мембранную фракции ультрацентрифугнрованпем при 140 тыс. я в течение 2 — 4 ч. В зависимости от локализации изучаемого фермента в качестве анализируемого материала используют культуральную жидкость, оесклеточный экстракт, растворимую или мембранную фракцию, Акашвность 4ерментое выражают в единицах. За единицу активности любого фермента (Е) принимают такое его количество, которое катализирует превращение ! мкмоля субстрата (или образование ! мкмоля продукта) в 1 лгин при определенных условиях реакции — рН и температуре. 5'Зельвал аканшность выражается числом единиц активности фермента, приходящихся на 1 мг белка. 13.2.1.
Липаза Липаза.(НФ 3.1.1.3) принадлежит к группе эстераз, катализирующих гидэолиз сложных эфиров глицерола с образованием глицерина и жирной органической кислоты. Способность разлагать жиры широко распространена среди микроорганизмов — бактерий, мицелиальных грибов (Азрег8Ииз, ЯЬ(~орцз) и дрожжей ( Синг(Ыа). У микроорганизмов липвза встречается в виде эндо- и экзофермента. Полагают.
что оптимум рН липазы микроорганизмов находится в области 8,0. Однако при выяснении наличия у объектов липолитической активности определение ведут как при кислом (4,5 — 5,6), так и при щелочном (7,6 — 8,5) значениях рН. Определение. Липазную активность изл1еряют спектрофотометрически с в-нитрофсннлпальмитатом (д-НФП) в качестве субстрата по увеличению поглощения при 405 нм в результате освобожлення и-нитрофенола (коэффициент молярной экстинкзни 18,3 мМ ' см ').
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
