А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 65
Текст из файла (страница 65)
Свидетельством чистоты культуры является однородность выросших колоний и совпадение их признаков с описанными ранее. 218 16.3. ГОМОАЦЕТОГЕНЫ (АЦЕТОГЕНЫ) Микроорганизмы, осуществляющие гомоацетатное брожение, продуктом которого является только ацстат, широко распространены в анаэробной зоне. Это строгие анаэробы, способные перерабатывать большой набор субстратов. Они связаны синтрофными связями с ацетокластическими метаногенамн, которые проводят реакцию: ацетат -+ метан+ СОь так как в пресных водоемах нет других возможностей удалить ацетат в анаэробных условиях.
Процесс хотя и называется брожением, однако часть реакций происходит за счет анаэробного дыхания. Можно сказать, по голюацетогены стоят на перепутье между бродильщиками и организмами, дышащими анаэробно, поскольку две молекулы ацетата образуются из глюкозы за счет брожения, а третья получается за счет анаэробного карбонсипного дыхания. Лцетогепы могут расти автотрофно на СО, + Н,„ образуя ацетат, при этом водород служит донором, а углекислота — акцептором электронов.
В этом случае АТФ генерируется с помогцью хемиоосмотнческого механизма, сопряженного с восстановлением углекислоты до ацетил- КоА (пугь Вуда — Льюнгдала). Возможен рост в атмосфере СО с образованием ацетата (4СО+ 2НзО -+ СН,СООН + 2СОг). Большинство ацетогенов способны к росту на одноуглеродных субстратах. Другие соединения, используемые некоторыми ацетогенами, — галактоза, рибоза, глюкуроновая кислота, глюконат, манннт, глицерин, метанол, многие спирты, органические кислоты н аминокислоты, целлобиоза и целлюлоза. АсегоЬасгегуигп нооь(й и некоторые кчострндии в присутствии СОз (СО) используют О-метильные группы большого количества метокснлированных ароматических кислот, включая ванилыгую, сиринговую, 3,4,5-триметоксибензойную, ферулиновую и др., для синтеза ацетата. Гомоацстогенные микроорганизмы распространены во многих таксономических группах.
Это представители родов С!овгпгйит, например С. Рдеппоасебсилц С фогт(соасебсит, С. гЬегтоаигоггарЬ(сит (рост при 70 С), Яроготиеа (Х оуага), АсегоБасгепит (А. »яхкЬГ, АсегоапаегоЬ(ил, Асегояеюпит, Асегдотаси(ит, АсегоЬа1оЬ(ит, Асегопета, МоогеИа„ЕиЬасгепит, Рергоьтгергососсие, Китвососсив, .»упггорЬососсив, Хаггоюиейа. Все они относятся к домену Васгепа.
Среди архей и эукарий ацстогенов пока не обнаружено. Для получения накопительных культур гаиаацетогенов следует использовать минеральные среды с витаминами н мнкроэлементамн на карбонатном буфере. Дяя выделения ряда культур следует добавлять дрожжевой экстракт. Поскольку в окислении Нг н формната гомоацетогены конкурируют с метаногенамн н сульфатредукторамн, необходимо созвать условия, «отсекаюгдие» обе этн группы. Гомоацетогены получают преимущества перед метаногенамн в слабокнслых условиях (рН 6,1) н прв пониженных температурах (ннже 20 С).
Для подавления метаногенеза добавляют соответствующие ингибиторы (ВЕВЛ). В средах для гомоацетогенов не используют сульфаты, чтобы не давать преимуществ лля развития сульфатредукторов. Поскольку гомоацезогены могут потребзить широкий спектр органических субстратов, в качестве селективного фактора можно применять пх способность к деметнлнроваьшю метокснлнрованных ароматических соединений. При этом следует учитывать, что использование таких субстратов может потребовать длительного периода адаптация. Источником биологического материала может служить образец любого анаэрабного доннвгв осадка нян рубцовой жидкости, отобранный без нарушения анаэробных уиювнй. 219 Среды и растворы. Для преимущественного развития, выделения, очистки и роста культур гомоацетогенов используют среду следункцего состава (г/л): КНзРО4 — 0,2; 1э'НкС! — 0,5; г!аС! — 1,0 (до 20,0 для образцов из соленых местообитаний); СаС1,— 0,15; М8С!з 6Н20 — 0,4 (до 3,0 для образцов из минерализованных вод); КС! — 0,5; резазурин — 0,001 (индикатор восстановительных условий); раствор микроэлементов— 1,0 мл/л; раствор витаминов — 0,5 мл/л.
Конечная концентриция лткроэлетентое в среде должна сосивить (мг/л): ГеС!з. 4НэО— 0,944; НэВОэ — 0,062; 7пС1, — 0,068; СцС1з — 0,013; МпС!з 4Н2Π— 0,061; СоС1,. 6Н,О— 0,066; )л(!С1, — 0,013; НС! — 0,002; )л(аОЙ вЂ” 0,400; !ЦафеОл — 0,017; !Ча,ЪЛ!Ок — 0,029; !л!а,МоО, — 0,021. Конечная конценн~рпция витатиное в среде составляет (мг/л); биотин — 0,01; фолиевая кислота — 0,01; никотинамид — 0,10; и-аминобензойная кислота — 0,05; тиамин (В,)— 0,10; пантотеновая кислота — 0,05; пиридоксамин — 0,25; цианкобаламин (Вц) — 0,05; рибофлавин (Вт) — 0,05. Метоксилированные ароматические субстраты (ванилат, ферулат, сирингат и др.) вносят в концентрациях 5 — 10 мМ. В случаях использования в качестве субсграгов спиртов и органических кислот (меланола, этанола, н-бутанола, н-пропанола, метоксиэтанола, малата и т.д.) их добавляют в количестве 1Π— 20 мМ.
Минеральную среду кипяпп для избавления от кислорода, затем охлаждают до комнатной температуры и разливают под током азота (свободного от кислорода) лля предотвращения диффузии кислорода в среду. Среды разливают во флаконы, закрывают резиновыми пробками и зажимают алюминиевыми колпачками.
Затем газовую фазу во флаконах дополнительно заменяют на требуемую; Аг, )л(ъ Нъ !л)~СО, (90/10) или Н,/СО, (80/20). Конечное давление во флаконах составляет -1,6 ат. Среды стерилизуют автоклавированием (1 ати), а раствор витаминов — фильтрованием (балтериальный фильтр диаметром 0,2 мкм). После стерилизации в среды вносят витамины, 30 мл/л 1 М !л)аНСОэ и добавлвют РаствоР 1Цазб 9Н,О до конечной концентРации 278 мг/л.
В качестве ингибиторов метаногенеза в среду вносят 2 мМ ВЕКА или 0,5 % ацетилена в газовую фазу. Для образцов из желудочно-кишечного тракта добавляют в среду 1% рубцовой жидкости. Все пересевы микроорганизмов осуществляют с помощью стерильных шприцев, не нарушая условий анаэробиоза. Накопительные культуры гомоацетогеиов. Для получения накопительных культур в анаэробную стерильную среду вносят до 20% (объем/объем) гомогенизированной пробы анаэробного осадка. После стерилизации среды устанавливают рН 7,1 — 7,3.
Культивирование проводят при 20 — 30 'С. Инкубировать накопительные культуры рекомендуется в полузаполненных сывороточных бугылях при их горизонтальном положении. Культивирование водородиспользующих гомоацетогенов проводят на орбитальной качалке или в шейкере для лучшего газообмена. Развитие накопительной культуры кошролируют после ! — 2 пассажей путем микроскопирования и наиболее часто отмечают наличие палочковидных нефлуоресцирующих клеток, обладающих активной подвижностью.
С помощью газожидкостной хроматографии определяют убыль молекулярного водорода и спиртов (без существенного образования метана), а также накопление ацетата. Трансформацию метоксилированного ароматического субстрата регистрируют с помощью ВЭЖХ. Для получения чистых культур гомоацегогенов используют расссв накопительной культуры на поверхность или в толщу агаризованной минеральной среды того же состава (с 1,5 — 2 % агара).
Стерильную апаэробпую агаризовацную среду в плотно укупоренных сосудах расплавляют, остужают до 45'С и стерильным шприцем вносят аликвоту культуральной жидкости из накопительной культуры с соблюдением условий анаэробиоза. После тщательного перамещивания содержимого сосуда его либо оставляют в горизонтальном 220 положении для застывания, либо раскатывают сосуд рукой по ровной поверхности до затвердевания агара по стенкам в виде тонкого слоя.
В обоих случаях лобиваются получения максимальной поверхности агаризованной среды. Допустим рассев накопительной культуры на поверхность твердой среды в чашках Петри петлей или шпателем при работе в анаэробном боксе и последующей инкубации посевов в анаэростате. Мел в агаризованной среде может служить индикатором образования ацетата (зоны просветления вокруг колоний), Культивирование ведут при 20 — 30 'С до появления отдельных колоний. При использовании в качестве субстрата молекулярного водорода очистку культуры проводят либо в тонком слое агаризованной среды, либо методом прелельных разведений в жидкой среде при перемешивании. Чистоту выделенных культур оценивают по однородности полученных колоний и микроскопической картины, а также путем рассева на твердые среды в аназробных условиях (в анаэробном боксе). Материал берут из отдельной колонии с помощью микробиологической иглы или петли и осуществляют поверхностный посев на среду в чашках Петри.
При глубинном посеве в толщу расплавленной агаризованной среды стерильным шприцем вносят суспензию клеток из отдельной колонии, приготовленную в стерильном анаэробном физрастворе. Через 2 пассажа проверяют чистоту выделенной культуры на богатых средах, содержащих 0,1% дрожжевого или солодового экстракта и пептона. Свидетельством чистоты культуры является однородность выросших колоний и совпадение их признаков с описанными в литературе. 1Б.4.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
