А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 72
Текст из файла (страница 72)
2Н,Π— 1; гча,МоО, — 3; !ч)С!к бН20 — 2 и 1 мл/л раствора витаминов (мг/л): 4-аминобензойной кислоты — 25; 27-биотина — 100; никотиновой кислоты — 25; пантотената кальция — 25; пиридоксина гилрохлорида — 25; фолиевой кислоты — 10; рибофлавина — 25; Вц — 0,5; липоевой кислоты — 25. Применяются также ряд других сред (Чапека, сусло-агар). !чодификаиии дяя выделения грибов: посев иа агаризованную среду, разлитую топким слоем в небольшие матрасы (объемом 100 мл); внесение большого количества антибактериальных антибиотиков, использование низких разведений (1: 1 — 1: !О) или прямого гюссва мслкозема.
Раствор минеральных компонентов кипятят лля улаления растворенного кислорода, потом остужают в кристаллизаторе с холодной водой. При этом через раствор продувают молекулярный азот, пропущенный предварительно через колонку с нагретой мелью для удаления из него следов кислорода. После охлаждения в раствор добавляют органические компоненты, витамины и микроэлементы. Срезу анаэробно (в токе 14,) разливают в стеклянные матрасы, в которых находились навески агара. В расплавленную, стерильную, негорячую среду добавляют стрсптомицин и хлорамфсникол в концентрации 200 мг/л среды. Посев мслкозема или почвенного разведения инкубируют в матрасах в атмосфере азота или аргона в течение 5— !2 сут при 24 — 26 'С. При выявлении группы почвенных грибоподобных протоктистов царства Спгоппз1а класса Оошусе1ез семейства Рубт(асеае порядка Регопозрога1ез (среди них много фитопатогенных видов) применяют пептоно-декстрозную среду Мартина.
Селективность среды для этих грибов создается введением антибиотика (!0 мкг/мл) пимарицина или эндомицина. Для выделения питиевых грибов из почв и растительных субстратов используют картофельно-декстрозный агар с добавлением 300 мкг/мл натриевой соли ампициллина и 17 мкг/мл фунгицида этаконазола с широким спектром действия. Для выделения грибов класса Сйутгилотусегеэ в среды дополнительно вводятся микроэлементы и витамины. Серьезные методические трудности сохраняются при попытках выделить из почв, подстилок и разрушающейся древесины грибы, которые играют важную роль в разложении органических веществ и формируют эктомикоризу у древесных растений. Белую гниль (грибами используются лигнин и целлюлоза) и бурую гниль (используется в основном целлюлоза) вызывают базидиомицеты. Аскомицеты и дейтеромицеты, разрушающие преимущественно целлюлозу, вызывают мягкую гниль и сине-зелено-черные окрашивания древесины.
Помимо непосредственного выделения из плодовых тел эти грибы могут быть изолированы непосредственно из древесины на сусло-агаре с беномилом (1 ррш), и споры аскомицетов и гифомицетов с помощью оттянутой стеклянной пипетки перенесены на агаровые среды. Для изоляции эктомикориэных грибов необходимо существенное усложнение сред, обусловленное их потребностями в специфических веществах.
Кроме того, из-за низкой скорости роста на традиционно используемых средах они не могут успешно конкурировать с более быстро растущими видами сапротрофных грибов. Показано„что беномил (в концентрации 5 ррах) может быть использован лля ограничения этих грибов при выделении базидиомицетов с эктомикоризных корней.
Среды, предназначенные для грибов, образующих эктомикоризу, обычно содержат какую-либо растительную вытяжку, чаше всего солод, в качестве источника углерода служат глюкоза, крахмал, пектин, источниками азота — соли аммония, гидролизат казеина, различные аминокислоты. В их состав входят также неорганические соли и во многих случаях — лликроэлементы и витамины. Одними из наиболее обычных сред для выделения эктомикоризных грибов из корней является среда Хагема и Мелина — Норканса (13.
РагЫпзоп, 1982). Микоризные грибы довольно чувствительны к реакции питательной среды. Большинство из них активно образует воздушный мицелий при рН 4,2 — 5,0, хотя многие способны развиваться в широком интервале рН (от 2,8 до 7,1). Температурный интервал, в котором грибы сохраняют способность к росту, также достаточно широк. Минимальная допустимая температура около 5 С, максимальная — около 30'С, оптимальная в большинстве случаев составляет 18 — 22 С.
Для вьщеления эктомикоризных грибов корни не должны быть подсушены и их тел1пература не должна повышаться при доставке в лабораторию. Корни промывают водопроводной водой для удаления почвы„разрезают на куски 2— 10 мм и помещают в банку с раствором детергента и встряхивают, промывают водой и обрабатывают дезинфицирующим раствором (г1аОС1, 1%-м раствором в течение 1О мин, 30%-й перекисью водорода (НгО,) — 5 — 20 с или 0,01%-м раствором сулемы (Н8С1г) — 2 — 3 мин). Затем корни промывают дистиллированной водой и переносят на агаризованные среды. Для грибов, образующих эндомикориэу (везикулярно-арбускулярную микоризу), к настояц1ему моменту не разработаны способы культивирования на питательных средах в чистой культуре. Существует несколько методов учета и изоляции спор эндолгикоризных грибов из почвы, основанных на их крупных размерах — влажное просеивание, центрифугирование в растворах сахарозы, при- 240 липание-флотация, дифференциальное осаждение в растворах желатина или глицерина.
Выделенные споры обрабатывают 5 — 20 мин 2 — 5 %-м раствором хлорамина для уни ггожения сопутствующих микроорганизмов. Споры эндомикоризных грибов способны прорастать на 0,75%-м агаре с добавлением экстракта почвы или водном агаре с дрожжевым экстрактом.
Для установления принадлежности спор к эндомикоризным грибам используют тест-растения, которые выращивак!т в стерильном песке или в пробирках на агаризованной среде и инфицируют их отдельными спорами. 18.2.2. Характеристика комплексов микроскопических грибов Для характеристики структуры комплекса сапротрофных микромицетов наиболее часто используют метод посева водных разведений почв на среды с просшыми углеводаыи — среды Чапека и Мартина, сусло-агар и картофельнодекстрозный агар, почвенный агар с сахарами, подкисленные молочной кислотой (4 мл/л) или с добавлением антибиотиков для подавления роста бактерий.
Применение этих сред позволяет выявлять, как правило, максимальное разнообразие сапротрофных микроскопических грибов, и одновременно они удобны для дифференциального учета колоний грибов в посевах, так как на этих средах дано описание культур в определителях. Наиболее летально па этих средах выявляется комплекс сахаролитических быстрорастущих грибов, хотя в него входят и грибы, обладающие разнообразными гидролитическими ферментами (целлюлазами, амилазами, пектиназами, липазами и др.). Для создания более оптимальных условий для выявления медленнорастущих грибов в среды вводятся соединения (бенгальский розовый, бепомил), сдерживающие развитие мукоровых грибов, триходермы и других микромицетов, образующих щирокорастущие, обильно спороносящие колонии. Выбор сред с другими источниками углерода (целлюлозой, крахмалом, пектином и т.д.) для выделения грибов позволяет полнее выявить микроскопические грибы, активно синтезирующие необходимые для роста на этих соединениях ферменты (т.е.
группы целлюлозолитических, амилолитических, псктинолитических грибов и др.). Применение сред с гуматами, лигнином и их производными или; голодного» агара дает возможность установить группу олигокарботрофных грибов и разрушающих гумусовые вещества. Посев ва агаровые аитательлые среды рекомендуется проводить из разведений 1: 10, 1: 100; 1: 1000; 1;! 0000 в зависимости от содержания грибов в почве. Последнее разведение используется лля лесных полстилок.
Йяя большинства почв о|ггимальиым является разведение в интервале 1: 100 — 1: 1000. На поверхность твердой питательной среды наносят одну каплю (50 мкл) почвенной суспеизии и с помощью стерильного шпателя распределяют ее по всей поверхности атаровой пластинки. При глубинном посеве в стерильные чашки Петри вносят по 1 мл водно-почвенной суспензии различных разведений, затем наливают охлажденную среду и, совершая осторожно круговые движения чашкой, распределяют суспензию по объему среды. Каждый из 5 — 10 образцов изучаемого биогеоцеиоза высевают иа 3 — 5 чашек Петри и иикубируют при 25 — 2б С.
Чашки Петри периодически просматривают, обычно начиная с 4 — 5-х сут, и отдельные колонии грибов в случае угрозы их зарастания мицелием быстрорастущих микромицетов отсеаают в пробирки или чашки Петри. Оптимальным считается разведение, когда иа чашках Петри выросло по 10 — 30 ко- 241 лоиий микроскопических ~рибов. Окончательный учет производится в зависимости от среды выделения — на сусло-агаре и синтетических средах с простыми углеводами на б — 12-е суг, на средах с целлюлозой, КМЦ через 2 — 3 нед, на голодном и почвенном агаре через 2 — 4 нед. Численность грибных зачатков в почве, выделяемых методом посева па твердую среду, рассчитывают по формуле а = бвг/д, где а — число грибных зачатков на ! г почвы; б — среднее количество колоний, на чашках; в — разведение, из которого сделан посев; г — количество капель в 1 мл суспензия; д — масса почвы, взятой для анализа.
Полученные данным метолом значения численности грибных зачатков (пропагул) позволяют составить представление о степени заселенности исследуемой почвы микроскопическими грибами. Для определения состава и предстанленности различных видов в изучаемой почве проводят выделение культур микромицетов из одной или группы одинаковых колоний.
Одновременно подсчитывают количество колоний в посене из данной почвы, которые представлены изолированными для идентификации штаммами. Выделение почвенных грибов для видовой идентификации осуществляют на среды Чапека — Докса, сусло-агар или другие среды в соответствии с систематическим положением организма. Каждый штамм нумеруют, записывают в лабораторный журнал принадлежность его к опрелеленному образцу и варианту опыта, что необходимо для дальнейшей обработки данных и характеристики структуры комплекса грибов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
