А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 75
Текст из файла (страница 75)
После экспозиции, время которой определяется предварительно экспериментальным путем (например, для фильтровачьной бумаги в верхнем горизонте почвы 7 — 10 дней), куски целлюлозы извлекают из почвы, очищают и помещают на твердую питательную среду с бактериальным ингибитором, а затем на неделю в термостат. Целесообразно использовать минеральную среду Гетчинсона без добавок органического вещества. Экспозиция на питательной среде и выдерживание в термостате как бы «проявляют» субстрат, так как стимулируют развитие спороношений у грибов и дают возможность их родовой идентификации. Пластинку микроскопируют целиком„оценивая заселенность отдельными грибами от общей площади пластинки и частоту их встрсчасмости на нескольких (5— 1О) пластинках в каждом варианте.
Затем при визуальном микроскопическом контроле грибы выделяют стерильной шлой в чистую культуру для видовой идентификации. При использовании этого метода наряду с обычными целлюлозоразлагающими удается выделить значительно большее разнообразие грибов, особенно медлсннорастуших темноокрашезшых форм, обычно плохо выделяющихся на твердые питательные среды. Выделение целлюлозоразрушающвх грибов из почв в лабораторных условиях.
Почву увлажняют до пастообразного состояния (60 % от полной влагоемкости) в чшшсах Петри. С помощью слегка увлажненного шпателя ее поверхность выравнивают и помещают полоску стерильной фильтровальной бумаги, хлопчатобумажного полотна или природные материалы с высоким содержанием целлюлозы (измельченную солому злаков, древесные опилки). На поверхность почвенной пластинки можно нанести тонкий слой порошковидной микрокристаллической целлюлозы или карбоксиметилцсллюлозы. Необходимо плотно прижать наносимый субстрат к почве и следить, чтобы он был увлажнен. Почвенные пластинки помещают во влажную камеру и инкубируют в термостате при 25 — 27 'С в течение нескольких недель. Если используются пластиковые чашки Петри диаметром 3 см, то их можно поставить в стеклянные чашки Петри диаметром 10 см, в которые налита вода (1 — 2 мл).
Появление грибного мицелия на целлюлазных материалах, как правило, происходит после недельной инкубации почвы, образование спороносных структур — на 2 — 4-й нед. Выделение грибов осуществлякп непосредственно с почвенной пластинки с субстратом на питательные среды Гетчинсона, сусло-агар и Чапека (кусочек мицелия или споры берут препаровальной иглой под контролем бинокулярного микроскопа).
Выделение амилолитического микробного сообщества. Метод предназначен для выяснения и оценки степени антропогенного воздействия на комплекс почвенных микроорганизмов (В. С. Гузев, 1991; Д. Г. Звягинцев, 1991). Одно- временно он может быть использован для выделения микромицетов, обладающих амилазами, и грибов, развивающихся на продуктах пщролиза крахмала в почве.
Готовят почвеннук~ пластинку в чашках Петри (3 — 4 см диаметром) и на ее поверхность наносят полоску тонкого слоя крахмала (в несколько зерен толщиной). Удобно наносить крахмал напылением или легким прижатием почвенной пластинки к нанесенному на лист бумаги порошку крахмала. Постоянную влажность почвы (60% от полевой влагоемкости) поддерживают, поившая чашки во влажную камеру (чашки Петри диаметром 1О см). В течение следующих 2 — 3 нед инкубирования почвы при 25 С наблюдают за развитием микроорганизмов на поверхности крахмала и под контролем бинокулярной лупы препаровальной иглой выделяют их на питательные среды. Выделение хитииразлагающих грибов.
Для выделения грибов, разлагающих хитин, используют препараты хитина или специально готовят приманку из покровных тканей насекомых, крабов или каракатицы. Предварительно ткани лекальцинируют в 10%-й НС1. Полученный хитинопротеиновый комплекс гидролизуют в течение 6 ч 10%-й МаОН при 105 'С в автоклаве.
Хитозан удаляют 5%-й НС1. Полученный хитин в виде пленки толшиной 0,25 мм разрезают на квадраты 0,5 х 0,5 см, приклеивают на покровное стекло, помещают в почву и выделяют через определенные периоды инкубации грибы, развившиеся на хитине. Выделение кератииофильных грибов и дерматофитов. Кератины — специфические серосодержащие белки, характеризуюшиеся высокой устойчивостью к различным биологическим и химическим воздействиям. В почву кератины могут попадать с покровных тканей животных (эпидермиса кожи, роговых образований, перьев, шерсти).
Ряд грибов может разлагать кератины, причем одни виды используют кератин мертвых тканей, другие способны развиваться и на живых тканях, вызывая заболевания — дерматомикозы. Поэтому выявление качественного состава и плотности популяций этих грибов может быть важным в специфических экологических местообитаниях — почвах животноводческих угодий, на территориях переработки кератинсодержащих соединений. Образцы почв (20 — 100 г) в нескольких повторностях отбирают с исследуемого участка, помещают в чашки Петри и увлажняют стерильной водой. На поверхность почвы наносят стерилизованные волосы лошади, овец, человека (лучше детские) (в виде кусочков длиной 4 — 7 мм) или другие приманки— шерсть животных, кусочки роговых тканей и т.д.
х1ашки термостатируют в темноте при 20 — 25 'С в течение 1 — 6 нед. Контроль осуществляют микроскопически при малых увеличениях (20 х 1О). При появлении мицелия приманки извлекают из почвы и переносят на среду Сабуро, содержащую циклогексимид (0,5 г/л) и хлорамфеникол (0,05 г/л). Затем мицелий, выросший вокруг приманок, пересевают на свежие косяки со средой Сабуро. Как характеристика плотности в почвах отдельных видов кератинофильных грибов учитывается процент приманок, заросших определенными грибами. При работс с кератинофильными грибами следует соблюдать особую осторожность, так как наряду с сапротрофными микромицетами возможно выделение патогенных дерматофитов.
Выделение фитоиатогеииых и михопаразитических грибов. Для выделения фитопатогенных грибов, которые определенный период своего жизненного цикла функционируют в почве как сапротрофы, в качестве приманок исполь- зуют различные органы растений. При выявлении видов рода Гизапит хорошими приманками служат стерильные кусочки клубней картофеля, для Рег(ЫИ!ит да(>((ае — отрезки стеблей, черенки и листья шелковицы, ивы, томатов, для Т(>(е!аиоряй (>аз(со(а — стерильные ломтики моркови, для фитофторовых грибов (Р(у(ор(>1(юги, Ру((>лв») — недозрелые яблоки и ягоды земляники, семена конопли, зрелый лимон. Для подавления роста типичных сапротрофных грибов на приманках в почву могут вносить фунгицид. Так, беномил добавляя>т для обнаружения грибов рода РЬу(ор(>г(х>га.
Исследуемую почву (не менее 10 г) раскладывают в стерильные ча>пки Петри или стеклянные стаканчики, заливают стерильной водой (в ряде случаев необходимо увлажнять до 60% от полной влагоемкости), помещая>т приманки и инкубируют в термостате, поддерживая установленную влажность почвы. Через 2 — 3 сут начинают просматривать приманки под бинокулярным микроскопом и появившиеся грибы отсевают на агаризованные среды. Используют, как правило. среды, в состав которых входят растительные отвары — овсяный, картофельный, кукурузный и дрожжевой экстракты и т.д.
(Билай, 1982). Так, при выделении грибов рода 1'ег((с((((ит свежесобранный растительный материал разрезают на фрагменты, очищают от коры, стерилизуют в 96%-и спирте и помещают в стаканчики с почвой на глубину 7 — 8 см. После 3 сут экспонирования при 24 — 26 С палочки вынимают и микроскопируют, регистрируя наличие конидиального налета у'ег((с(1((ил> с(и(>((ае на участке, расположенном на границе почвы с воздухом. По количеству отрезков с конидиальным спороношением можно характеризовать относительную инфекционность образцов почвы. Однако следует учитывать, что такой тип конидиального спороношения свойствен не только У, с(а(>йае, но и другим вилам вертициллов, обитающим в почве. Поэтому в данном случае, как и с другими фитопатогенами, необходимо их выделение в чистую культуру на питательные среды, которые существенно различаются по составу для разных фитопатогенных видов грибов.
Микопаразитические грибы обычно легко обнару>кить в природной обстановке на плодовых телах по их деформации и изменению цвета. С помощью препаровальной иглы или оттянутой стеклянной пипетки неболыпое количество конидий или аскоспор выделяется в чистую культуру непосредственно на среды с антибактериальными антибиотиками.
Для выделения почвообитающих грибов, обладающих микопаразитическими свойствами (СотоЯупит гл(лйи, видов Тпс(>ойегтп, б((ос(аг((ит, Та(аготусез), в качестве приманки используют инкубируемые в почве склероции Юс(еголл(уь 18.4.3. Метод кловчих растений» для выделения фитопатогенных грибов Метод ловчих растений», т.е. вегетирующих растений-хозяев, их проростков или укорененных пасынков, с успехом применяется для выявления фитофторовых грибов. Почву в чашках Петри заливают водой до полного насыщения. Здоровые сеянцы восприимчивого растения на стадии семядольных листьев, которые предварительно были пророщены в чашках Петри на увлажненной фильтровальной бумаге, раскладывают в чашки Петри с почвой.
Для 250 стимулирования инфицирования сеянцев их перед высадкой в почву накалывают препаровальг(ой иглой. При таком способе на растениях через 5 — 7 дней инкубирования при 20 — 22'С в зараженной почве обычно хорошо заметны первые признаки развития возбудителя. На заролышевых корешках сеянцев обнаруживаются участки с побуревшей и размягченной тканью. При микроскопическом анализе хорошо просматриваются образующиеся на поверхности пораженных корней спорангии. Органы полового размножения (ооспоры) гриба образуются спустя 10 — 15 сут.
18.5. ВЫДЕЛЕНИЕ ГРИБОВ ИЗ РИЗОСФЕРЫ, РИЗОПЛАНЫ, НАДЗЕМНЫХ ЧАСТЕЙ РАСТЕНИЙ И РАСТИТЕЛЬНЫХ ОСТАТКОВ Подготовка образцов. Вьщеление грибов из ризосфсры и ризопланы и надземных частей растений имеет ряд специфических особенностей, что вызывает необходимость дать отдельное описание этих методов. Подготовку почвы и корней необходимо проволить в день отбора проб. Корни растений отбирают вместе с монолитом почвы. Д!и сравнения берут образцы контролы юй почвы (из междурядий или с аналогичного по почвенным свойствам участка без расппегп ности). В качссгве ризосгрерной почвы берут слой почвы вохр!т корней до 3 — 5 мм. Ризосферную по гву можно удалить с корней посредством водных смывов.
Навеску корней с почвой (5 — 10 г) помещают с помощью простерилизованного наа пламенем пинцета в заранее подписанные колбы со !00 мл стерильной воды и встряхивают на качалке в течение 15 мин. Корни предварительно разрезают на фрагменты 3 — 5 см. Отмытые корни вынимают микробиологическим крючком из колбы, помещают между листами фильтровальной бумаги, полсушивают для удаления остатков влаги и взвешивают. По разности массы корней с почвой и отмытых корней определяют массу ризосферной почвы (при полевой влажности почвы на день отбора проб). Для представления данных в расчете на воздушно-сухой все проводят определение полевой влажности почвы и затем соответствующие корректировки.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
