А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 78
Текст из файла (страница 78)
Исходную суспензию готовят, помещая навеску почвы в колбу с 90 мл жидкой питательной среды !остальное количество среды пошло на смачивание почвы). Суспензию взбалтывают в течение 10 — 15 мин, затем оставляют на 30 с для осаждения крупных почвенных частиц и готовят из нее второе разведение. Культивирование микроорганизмов осуществляют при 22 — 24 С, проводя гиикроскопический контроль в течение месяца, учитывая ин- и эксцистирование различных видов простейших, происходящее в разные сроки.
Для количественного учета простейших с помощью таблицы Мак-Креди подсчитывают число пробирок, в которых они размножились. На основании полученных результатов составляют числовую характеристику, состоящую из трех цифр. На первом месте отмечают число пробирок того разведения, где во всех повторностях развилась культура простейших !обычно зто 3 пробирки).
Следующие две цифры обозначают пробирки с развившейся культурой из двух последовательных разведений. По таблице Мак-Креди находят вероятное число, соответствующее числовой характеристике. Для пересчета количества простейших на 1 г почвы полученное число умножают на разведение, в котором во всех пробирках был отмечен рост простейших. При анализе свежей почвы необходимо учитывать влажность субстрата, лля определения которой можно использовать формулу гл = !а — Ь)100/(а — с), где а — масса влажной земли и тары; Ь вЂ” масса высушенной земли и тары; с— масса тары; и — влажность почвы, %. Разведение по Кетлеру, Желательно приготовить не менее 15 разведений !1: 10; 1: 100; 1: 1000; 1: 2500 и т.д.).
Для приготовления разведения 1: 10 берут 10 г почвы и разводят их в! ОО мл стерильной водопроводной воды. Затем из каждого разведения берут 1 мл суспензии, которую необхолимо предварительно взболтать, и помещают в жидкую питательную среду сенного настоя с почвенной вытяжкой (приготовление см.
в приложении 4). Культивирование проводят при 22 — 24 'С. В течение месяца через определенные промежутки времени проводят микроскопические исследования (при увеличениях 8х и 40х) и устанавливают наибольшее разведение, при котором обнаружено развитие простейших. Количество простейших должно соответствовать числу, находящемуся между двумя ближайшими наибольшими разведениями, из которых последующее не дало роста простейших. Например, 1 мл суспензии из разведения 1: 2500 дал развитие простейших, а 1: 5000 не дал его, следовательно, число простейших лежит между 2500 и 5000 на 1 г почвы. Метод Сингха. В чашки Петри помещшот по 8 стеклянных колец (внутренний диаметр 2 см, глубина 1 см, толщина 1 — 2 мм) и стерилизуют.
Затем в чашки Петри разливают 20 мл стерильного расплавленного «голодного» агара (1 — 1,5%-й агар, солержашнй 5 г/л !ЧаС! и 1 г/л СаСОз). Кольца стерильным пинпетом размещают по периферии чашки на одинаковом расстоянии так, чтобы среда попала в каждое из них. После застывания агара в каждое кольцо вносяг каплю густой суспензии одной или нескольких бактериальных культур, потребляемых простейшими, например Е. сод или АгоГоьасГег сЛпюсоссит.
Чашки инкубируют в течение суток при температуре 37 или 30 С соответственно. 9 нпиачв йля приготовления почвенной суспензии 10 г почвы смачивают стерильной водой, растирают в стерильной ступке напалечником и переносят в 50 мл стерильного физиологического раствора нлн в стерильную водопроводную, прудовую или дождевую воду. Суспензию встряхивают в течсние 5 мин, оставляют на 30 с для осаждения крупных частиц почвы и готовят ряд разведений (не менее 15). Из исходного разведения ('/,) лелают большие разведения — от '/ю до '/и юе, путем разведения 5 мл суспензии, взятой из предыдущего более слабого разведения, в 5 мл стерильного физиологического раствора или водопроводной воды.
На чашке Петри 8 колец заражают 0,05 мл из определенного разведения. Затем чашки инкубируют 15 — 30 суг при 22 — 24 С. Через.4 — 6 сут культуру микроорганизмов просматривают пол микроскопом с увеличением 8х или 40х для обнаружения и идентификации простейших. Численность простейших определяют путем подсчета колец, имеющих простейших и лишенных их„из каждого разведения (табл. 19.1; 19.2).
Таблица 19.1 Количество колец с простейшими и без них прн разных разведениях Амебы ЖгЗчиконссны Инфузорни Разведение 1/! 0 1/1 5 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 1/2560 1/5120 !/!0240 1/20480 1/40960 1/81920 Всего 80 94 В итоге имеем Амебы Жгутиконосцы Инфузории Культуры с простейшими (+) ..................... 80................... 86 ......................
26 Культуры без простейших (-) .....„,.„„„,...... 40 .............,..... 34 ...................... 94 Число на ! г почвы (см. табл. 19.2) ......... 4!400 ............. 70500 .................. 377 258 Т а б л и ц а 19. 2 Определенно численности простейших методом разведений (на ! г почвы при разведении от 5 до 81920 раз в 8 повторностях на 15 чашках) Огрицательные ! Культурь! Орта- Отриценизмы тельные(на 1 г) культуры Организмы (на 1 г) Оргтн низмы (на 1 г) Гирице- тельные культурыы Отрицателыеые кулыуры Ор~а- Отрица- Организмы тельные янзцы (нз 1 г) кульгуры (на 1 г) 132000 50 317 51 5 6 7 ! 3 9 ! 10 1! 12 13 121000 290 265 110000 53 243 101000 54 92000 223 55 203 56 77100 57 169 !54 70500 64500 140 60 126 14 61 15 49400 113 101 90,2 79,4 69,5 60,2 51,3 42,9 34,8 27,4 16 45200 63 17 41400 37900 18 65 19 34700 20 67 3920 3600 21 29200 26700 68 22 91 3300 92 3020 93 2770 94 2540 95 23 24500 24 70 22400 71 377 20500 346 19.1.3.
Определение числа активных форм и цист Метод Северцовой. Для количественного учета амеб чашки Петри с агаризованной средой заражают бактериальной культурой в форме креста; таких крестов наносят 10 — 15 на каждую чашку. развивающиеся культуры не должны соприкасаться между собой. В центр каждого креста вносят около 0,12 мл почвенной суспензии (10 г почвы в !ОО мл стерильной воды). Приготовление почвенной суспензии и последовательных разведений осуществляют квк было 259 !690000 27 1430000 28 1230000 29 1060000 ЗО 931000 31 824000 32 729000 33 65ОИ)0 34 581000 35 520000 36 467000 ' 37 421000 38 380000 39 344000 40 31!000 41 282000 42 256000 43 232000 44 2!1000 45 192000 46 175000 47 159000 48 145000 49 17300 73 15800 74 14500 75 13300 76 12200 77 !1100 78 10200 79 9380 80 8570 81 7860 82 7210 83 6600 84 6040 85 5540 86 5030 87 4670 88 4280 89 2330 96 2140 97 1960 98 !300 99 1650 100 1510 101 1390 102 1270 !03 1170 104 !070 105 979 !06 398 107 823 108 755 109 693 110 635 111 582 112 534 113 490 114 450 !15 412 116 указано выше.
Чаппси помещают в термостат при температуре 22 — 24'С и наблюдают за появлением роста протист на крестиках. Исходя из положения, что одна амеба дает начало одной колонии, подсчитывая число крестиков с амебами, можно оггределигь их число в исходной пробе. Например, на крестики внесено по 0,12 мл суспензии почвы с разбавлением в 100 раз. Из 20 крестиков 10 оказались с простейшими, а 10 без них. Отсюда можно предположить, что лишь в половине порций по 0,00012 г находилось по одному простейшему, давшему начало культуре. Следовательно, в 1 г находилось от 4166 до 8332 простейших: 1 г/0,00012 г = 8332; 1 г/(0,00012. 2) г = 4166.
На основании подсчетов, произведенных на нескольких чашках, берут среднее из всех разведений почвенной суспензии, опуская минимальные и максимальные числа. Для определения числа активных форм и цист, находягцихся в суспензии, последнюю нагревают до 60 — 70'С, т.е. до температуры, при которой гибнут активные простейшие. К недостагкам этого метода можно отнести вероятное переползание простейших из одного креста в другой„а также возможное повреждение цист уже при 58 С. Метод Кетлера. Одновременно с приготовлением серий разведений берут 10 г той же почвы и обрабатывают ее аликвотой 2%-го раствора НС1 так, чтобы созлать некоторый избыток кислоты после нейтрализации карбонатов.
Почву оставляют на ночь, в течение этого времени все активные формы погибают, а цисты сохраняют жизнеспособность. Затем почву разбавляют таким же способом, как и не обработанную соляной кислотой. Дальнейшее развитие на питательной среде обнаруживает лишь тех простейших, которые развились из цист. Разность между первым и вторым подсчетом дает число активных простейших. Просмотр питательной среды при этом следует производить очень часто — вначале до двух раз в сугки, так как численность активных форм и цист быстро меняется.
19.1.4. Физиологическая активность и распространение простейших в почве Изучение распространения простейших в почве. Для проведения эксперимента почву доводят до воздушно-сухого состояния, отсеяв крупные частицы. размельчают, просеивают через сито 0,25 мм и помещают в чашки Петри так, чтобы она равномерно располагалась по дну. Если изучают активность простейших в зависимости от механического состава почвы, в чашки Петри помещают отдельные фракции увлажненной до полной влагоемкости почвы.
На почве, находящейся в чашке, делают отметки через ! см от центра, после чего чашки стерилизуют при 2 ати в течение 30 мин. Затем в центр чашки с почвой в небольшое углубление помещают 1 — 2 петли культур простейших или комочек почвы, зараженной простейшими. Зараженные чашки инкубируют при 22— 24'С в камере или под стеклянным колпаком для избежания испарения. Ежедневно с каждого участка тточвы, начиная от центра к периферии, берут пробт почвы и переносят в стерильную питательную среду (в чашки с плотной средой или в колбы с жидкой средой). 260 Ежедневно, начиная со следующего дня, среду используют лля обнаружения простейших.
Если, например, через два дня после заражения почвы простейшими, последние будут обнарухгены в колбах, в которые были внесены пробы почвы с расстояния 1 и 2 см от места заражения, а проба с расстояния 3 см в колбе окажется стерильной, то, следовательно, в течение 2 сут простейшие распространились на 2 сл1 или несколько больше 2 см. Таким же способом вьисняется распространение почвенных бактерий. Распространение простейших в стерильной почве показывает их активное движение и размножение, по зависит в свою очередь от механического состава почвы и ее влажности.
Изучение питания простейших. Для выявления пищевых предпочтений разных видов простейших необходимо иметь чистые культуры протист (амеб, инфузорий или жгутиконосцев), а также бактерий, принадлежащих к олигонитрофильным микроорганизмам, нитрификаторам, аммонификаторам, денитрификаторам, аэробным целлюлозолитикам, спорообразующим бациллам. Широкий выбор бактериальных культур объясняется их избирательным выеланием различными предсгавителями простейших. Перед началом эксперимента определяют плотность популяции простейших (микроскопически в камере Горяева, см.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
