А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 108
Текст из файла (страница 108)
Гилролиз исследуемого образца. Подготовка среды для тест-организма — К тагхгапив 734. Пересев тест-культуры за 36 ч до занятия 2. Занятие 2. Определение никотиновой кислоты Занятие 3. Оформление результатов задачи. Зачет. ЗАДАЧА 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНОЗИТА Инозит, или витамин Ва, — шестиатомный циклический спирт, хорошо растворимый в воде. В продуктах животного происхождения инозит находится преил!ущественно в связанной форме, главным образом в виде фосфолипидов, а в растениях — в виде эфира фитина, обладающего витаминными свойствами. Суточная потребность в инозите для человека составляет 1,0 — 1,5 г. Этот витамин находится практически во всех продуктах животного и растительного происхождения, но особенно много его в печени, мясе„хлебе, картофеле, зеленом горошке.
369 Цель рабов!!л: определение содержания инозита (витамин Вн) в одном из продуктов питания (мясо, картофель, хлеб, зеленый горошек) микробиологическим методом. Ход выполнения задачи Микроорганизм и его культивирование. В работе используют тест-культуру дрожжей К!дуг егоглусез Фегто101егапх У-533. Дрожжи выращивают на среде состоящей из 7 Б сусла и 2%-го агара, н течение 48 ч при 28 С и хранят н холодильнике. Метод основан па определении интенсивности роста штамма дрожжей К.
бестию!егаьв 1'-533, не способного синтезировать инозит, в жидкой среде. Интенсивность роста тест-культуры зависит от количестна инозита н образце. Для выявления витамина в исследуемом образце пищевого продукта необходимо предварительно подвергнуть этот образец экстракции путем гилролиза. Для этого 1 г хорошо измельченного образца смешивают с 30 мл 6 н.
раствора соляной кислоты и автоклавируют н течение! ч при ! ати. После этого экстракт охлажцают, подщелачинают с помощью 1 н. р-ра !з!аОН цо значения рН 5,5 — 5,8 и доводят объем до 100 мл в мерной колбе дистиллированной водой. Приблизительная концентрация инозита н образце должна быть 5 — 6 мкг/мл, При необходимости делают разведения, как это описано для никотиновой кислоты. Использующийся для построения калибровочной кривой стандартный образец инозита подвергается аналогичной обработке. Содержание инозита а ряду стандартных растворов, использующихся для построения калибровочной кривой, должно соответствовать 1,2; 0,6; 0,3; 0,15; 0,075 мкг/мл.
В качестне контроля используется дистиллированная вола. Для определения инозита используют среду Ридер, содержащую (г/л): глюкоза— 40,0; (ХНс),8΄— 6,0; М88О4 — 1,4; ! !аС! — 1,0; КН,РО, — 2,0; К,НРОс — 0,2; пантотенат кальция — 0,005. Вода дистиллированная, рН среды до стерилизации 5,5 — 5,7.
Перед доведением значения рН среду обрабатывают актинированпым углем из расчета 5 г угля на 100 мл 20%-го раствора глюкозы и фильтруют через бумажный фильтр. Ход определения. Определение ведут н двух повторностях. Для этого в штативе расставляют 2 ряда пробирок по 6 н каждом ряду. В каждую пробирку разлинакзт по 2 мл дистиллированной воды. Затем в первые пробирки ряда вносят по 2 мл раствора образца или стандартного раствора инозита при построении калибровочной кривой. В обоих ряцах пробирок делают 5 последонательных двукратных разведений, перенося по 2 мл раствора из первой пробирки раца в последующие.
После этого во все пробирки стерильно добавляют по 2 мл питательной среды. В качестве контроля используют пробирку, содержащую 2 мл дистиллированной воды и 2 мл питательной среды. Растворы н пробирках стерилизуют при 0,5 ати 15 мин, охлаждают и вносят посевной материал по ! капле в пробирку. В 1 мл суспензии дрожжей, используемой в качестве посевного материала, должно находиться около 1,6 1Оз клеток. Засеянные пробирки инкубируют 48 ч при 28 — 30 'С. Интенсивность роста тест-культуры в пробирках со стандартными и исследуемыми растворами измеряют на ФЭК при ллине волны 540 нм н кювете с длиной оптического пуки 0,3 см.
Количество инозита в образце определяют по калибровочной кривой. Полученные результаты вносят н табл. 31.6. Материалы, оборудование, посуда, реактивы Пробирки — 40; пипетки ца 1 — 2 мл — ! 5; колбы на 500 мл; цнлинлр мерный на 100 мл; ФЭК; штатив для пробирок; инозит; активированный уголь; реактивы для приготовления сред. 370 Таблица 31.6 Количество ииозвта в образце План проведения задачи Для проведения задачи необходимо 10 в 12 ч. Занятие 1. Приготовление н стерилизация среды для определения инозита. Гидролиз исследуемого образца. Подготовка среды для тест-организма — дрожжей К.
Йепио!о!еголз 'г'-533. Пересев тест-культуры за 36 ч до занятия 2. Занятие 2. Определение инозита. Занятие 3. Оформление результатов задачи. Зачет. Глава 32 ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ БЕЛКИ БАКТЕРИЙ У все большего числа белков обнаруживают способность проявлять нс одну, а две или несколько различных активностей, причем с помогцью различающихся механизмов (лля чего в молекуле белка должно быть несколько активных центров).
Такое множественное проявление биологической активности белков называют полп4ункциональногтью. Полифункциональность белков находится в соответствии с принципом экономии генома и вполне обоснована с точки зрения современных знаний об эволюции белков, их доменной организации. Полифункциональные белки синтезируют как эукариоты, так и прокариоты. Например, лизоиимль образуемые множеством животных, не только гидролизуют пептидогликан бактсриальных клеток благодаря своей ферментативной активности, но и разрушают их цитоплазматическую мембрану, используя еще до конца не известный механизм.
Мембранотропная активность лизоцима сохраняется даже после потери им Ферментативной активности, например в результате кипячения. Два белка, выделенные с поверхности клеток азотфиксирующей бактерии Вас!!!иг ро!ул~уха, проявляют бактерицидную, протеолитическую активности, а также адгезивные свойства, т.е. являются одновременно антибиотиками, Ферментами илектинами.Лектонм — это белки,которые способны обратимо и избирательно связываться с углеволами. Лектины (агглютинины) могут осаждать углеводсодержащие соединения, агглютипировать клетки и определенным образом влиять на их метаболизм, например активируя автолизины этих клеток.
Известно, что лектнны принимают участие в специфической адгезии бактерий к клеткам корней и других органов растений, а также к клеткам животных. Лектины пссвдомонад, ризобий„азоспирилл могут выступать и в качестве бактериоцинов. 371 Агглютинины прокариот играют важную роль при образовании различных симбиозов. Наиболее изучены лектины ряда патогенных бактерий, являющиеся токсинами, а в ряде случаев проявляющие различную антибиотическую активность. У бактерий„патогенных для растений и животных, лектины могут быть тесно связанными с фимбриями, а также находиться на поверхности клетки или экскретироваться из нее. Например, типичным лектином считают экзотоксин гуЬпо сЬо1егае, обладшощий протеолитической активностью. Полифункциональны Сгу-белки Вас!!1пг 1Ьиллхчепг1з — высокоспецифичные токсины некоторых насекомых и других беспозвоночных (нематод, кле1цей), проявляющие также свойства антибиотиков, бакгериоцинов, лектинов.
Такие белки образуют вклетках В. 1Ьиппя1еьх(г параспоральцые кристаллы, способные длительное время сохраняться во внешней среде наряду со спорами. В состав кристаллов некоторых подвидов В. 1Ьиппягеаз1з кроме Сгу-белков однгжо или нескольких классов могут входить также цитолитические Суг-белки и некоторые малоизученные белки. При попадании в организм чувствительного беспозвоночного вместе с пищей кристаллы растворяются, Сгу-белки разрушают мембрану клеток кише шика жертвы.
В результате этого жертва погибает, и внутри ее тела начинают прорастать споры бациллы. На первых этапах развития популяции клеток В. 1Ьиг1лягелз1з из проросших спор антибиотическое действие Сгубелков, а также других белков параспоральных кристаллов защищает бактерий В. 1Ьиг(лйгепзгз от конкурирующей микрофлоры, пока сама молодая популяция этих бактерий не достигнет кворума и пе станет способной синтезировать различные антибиотические соединения. Способность Сгу-белков связываться с углеводами важна как для их токсического, так и для антибиотического эффекта.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
