А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 104
Текст из файла (страница 104)
Для определения антимикробных свойств штамма используют следующий набор тест-микроорганизмов: 5!арйу!асассил аигеил, Егсйег!сЬ!а соЬ; Рга!еиа ги!лат, Вас!Вил секет, Вас!!!ил туса!дел, Мссгасассил !и!еил, Вггерготусел апи!алле уаг. ег!зеил, Саад!да яи!!!!егтопд!1, МусаЬасгег!ит вр., Реп!с!!!!ит !ип!со!охит, ЛЛада!аги!а аигапйаса.
В.сегеил используют также для определения количества образуемых актиномицинов методом диффузии антибиотиков в агаризованные среды и при биоавтографии антибиотика. Состав используемых сред (г/л). Среда ! для поддержания стрептомицета: гороховая мука — 50,0; агар — 20,0 и бульон Хоттингера — 15 мл; вода водопроводная до 1 л. Среду готовят в пробирках по 5 и 20 мл. Стерилизуют в авто- клаве при 0,5 ати, рН 7,0 — 7,2. Среда 2для определения антимикробньтх свойств штамма: глюкоза — 30,0; пелтон — 1,0; К)ЧОз — 3,0; КзНРОл — 0,2; МйБ΄— 0,5; )ЧаС! — 1,0; 7п504 — 0,02; ГеоОл — 0,02; вода дистиллированная до 1 л. Среду готовят в пробирках по 20 мл и стерилизуют при 0,5 ати, рН 7,0 — 7,2. Среда 3 для выращивания посевного мицелия стрептомицета: глицерин — 30,0; пелтон — 5,0; К)ЧОз — 0,5; КзНРОл — 0,4; в!ЫЯОл — 1,0; )ЧаС! — 0,1; вода водопроводная до 1 л.
Среду готовят в качалочных колбах на 750 мл по 100 мл и стерилизуют при 0,5 ати, рН 6,5 — 7,0. Среда 4 для глубинного выращивания стрептомицета и биосинтеза антибиотика: глюкоза !или глицерин) — 30,0; К)ЧОз — 4,0; КзНР04 — 0,2; Мд$04 — 0,5; )ЧаС! — 1,0; Хп$0л — 0,02; ГеБОл— 0,02; вода дистиллированная до 1 л. Среду готовят в качалочных колбах на 750 мл по 120 мл и стерилизуют при 0,5 ати, рН 6,5 — 7,0. Среда 5 для определения количества актиномицинов методами диффузии и биоавтографии: !Ча,НРО4— 3,0; агар — 20,0 и бульон Хоттингера — 500 мл; вода водопроводная до ! л, рН 7,0 — 7,2.
Среду готовят в колбах по 250 мл и стерилизуют при 0,5 ати. Растворы аминокислот: Е-валина, Е-изолейцина, Е-лейцина, Е-норвалина, готовят в пробирках, содержащих одну из аминокислот в количестве 100 мг/! О мл дистиллированной воды. Стерилизуют при 0,5 ати. Методы анализов 1. Определение антнмикробных свойств стрептомпцета. В стерильные чашки Петри наливают по 20 мл расплавленной среды 2. После ее застывания на поверхность агара изогнутой бактериологической петлей наносят по диаметру чашки полосу шириной 2 см воздушного мицелия стрептомицета из 6 — 7-суточной культуры, выросшей на среде 1. Полосу для более точной работы отмечают на внешней стороне чашки стеклографом. Чашки помещают на 5 — 7 сут в термостат при 28 'С.
После этого перпендикулярно к полосе выросшего стрептомицета на агар наносят штрихи из суспензий тест- микроорганизмов. Штрихи проводят бактериологической петлей от полосы стрептомицета, не касаясь его, к кракз чав!хи. Суспензия готовят в стерильной водопроводной воде из суточной культуры тест- микроорганизмов, выросших на среде 5. Названия микроорганизмов пишут на нижней стороне чашки Петри, Чашки ставят в термоствт при 30 С н просматривают через сутки. Чувствительность микроорганизмов к антибиотику, образуемому стрептомипетолй 355 определяют по величине зоны отсутствия роста и выражают в миллиметрах. Результаты представляют в табл. 30.1, Таблица 30.1 Автимикробиые свойства стрептомицета Подавление роста, мм Микроорганизм 2. Определение образования антибиотика при роете стрептомицета иа средах разного состава.
В этой части задачи в процессе роста стрсптомицета определяют скорость нарастания биомассы мицелия, количество антибиотика, антибиотическую продуктивность в зависимости от возраста культуры и состава среды. Изучают морфологию стрептомицета. Колбы со срслой 3 засевают воздушным мицелием в количестве ! см' мицелия б— 7-дневной культуры стрептомицета, выросшего на среде 1, на колбу. Выращивание проводят на качалке при 28 С в течение 36 — 48 ч. Из полученного посевного мицелия вносят по 5 мл перемешанной культуры в оцытныс колбы, содержащие по 120 мл срелы 4, и ставят на качалку при 28 С. Через 24 и 48 ч в отдельные колбы вносят растворы одной из алшнокислот в количестве 100 мг на колбу и вновь ставят на качалку. Таким образом создаются условия для изменения компонентного состава актиномицинового комплекса. Отбор проб.
Опыт длигся 96 ч, пробы отбирают через каждые 24 ч. Содержимое каждой опытной колбы тщательно перемешивают и стерильной пипеткой отбирают 3 мл культуры, из которых одну каплю наносят на предметное стекло, а остальное вносят в чистую сухую пробирку. К пробе в пробирке добавляют 3 мл этанола, пробирки закрывают резиновыми пробками с парафильмом и оставляют при комнатной температуре в темноте до конца опыта. Добавление этанола обеспечивает консервацию пробы, а также растворение актиномициновых антибиотиков, плохо растворимых в воде и находящихся в культуральной жидкости в виде взвеси мелких кристаллов и осадка на поверхности мицелия. Микроскопироваиие.
Каплю культуры стрептомицета с каплей воды распределяют тонким слоем по предметному стеклу, подсушивают на воздухе, фиксируют жидкостью Карнуа, красят 3 — 5 мин метиленовым синим по Леффлеру. Препарат осторожно промывают водой, подсушивают на воздухе и просматривают с иммерсией в световом микроскопе, отмечая: толщину, длину, ветвление периферических гиф мицелия, степень базофилии, дифференциацию мицелия !образование светлых участков, темной зернистости, капель волютина, глубинных спор), плотность микроколоннй, распад на фрагменты, автолиз. Отмечают морфологические особенности мицелия в период активного синтеза антибиотика.
Результаты записывают и зарисовывают. Определение биомассы. Содержимое пробирок с отобранными и залитыми зтанолом пробами после растворения актиномицинов (жидкость окрашивается в оранжевый цвет, осадок мицелия — бесцветный) фильтруют через пронумерованные, доведенные до постоянной массы бумажные фильтры. Фильтры с мицелием высушивают в сушильном шкаФу при 100 'С, взвешивают и по разнице массы фильтров с мицелиелг и без него вычисляют величину биомассы мицелия, которую выражают в мг АСБ/мл культуральной жидкости. 356 Отфильтрованную в чистые сухие пробирки смесь культуральной жидкости и этанола (1: 1) используют для определения количества антибиотика.
Колориметрическое определение количества антибиотика. Определение основано на хромофорных свойствах актиномицинов и зависимости поглощения света от количества антибиотика в растворе. Из стандартного раствора антибиотика в этиловом спирте (500 мкг/мл) готовят серию разведений в дистиллированной воде с содержанием 50; 25; 12,5 и 6,2 мкг/мл антибиотика. Измеряют величину поглощения растворов на ФЗК при 400 нм в кюветах с длиной оптического пути 0,5 см и строят калибровочную кривую. В таких же условиях измеряют опытные образцы с обязательным точным разведением в случае высокого содержания а~гтибиотика.
Прямая зависимость величин экстинкции и концентрации вещества сохраняется при 5 — 50 мкг/мл актиномицина. Количество антибиотика рассчитывают по калибровочной кривой с учетом разведений (в том числе в два раза при отборе проб) и выражают в мкг/мл культуральной жидкости. Биологическое определение количества антибиотика. Определение основано на диффузии антибиотика в агаризованную, содержащую тест-микроорганизм среду и учете подавления его роста. Величина диаметра зон подавления роста в определенных пределах пропорциональна логарифму концентрации ш пибиотика.
Из стандартного спиртогюго раствора актиномицина (500 мкг/мл) готовят в дистиллированной воде серию разведений с 50; 25; 12,5 н 6,2 мкг/мл антибиотика. Опытные образцы также разводят до приблизительного солержания антибиотика 5 — 50 мкг/мл. Расплавляют 250 мл среды 5 на водяной бане, охлаждают до 60 — 65 'С и вносят в среду 5 — 7 мл густой суспензии тест-микроорганизма В. сегеш, выросшего в пробирках на среде 5. Среду перемешивают и быстро выливают на горизонтально распшюженный лоток размером 30 х 30 см. После застывания в агаризованной среде стерильным пробочным сверлом делают лунки диаметром 5 мм на расстоянии 2 — 3 см друг от друга. В лунки вносят точное и одинаковое количество стандартных (четыре концентрации) н опытных (две концентрации) растворов антибиотика.
Лоток помешают в термостат при 30'С. Через 24 ч измеряют диаметры зон подавления роста тест-микроорганизма. На полулогарифмической сетке строят кривую зависимости величин зон подавления роста тсст-микроорганизма от концентрации антибиотика в стандартных растворах. По калибровочной кривой рассчитывают содержание антибиотика в опытных образцах в мкг/мл культуральной жидкости. Калибровочная кривая строится д;ш каждо~о используемого в работе лотка салгостоятельно. Расчет аитибиотической продуктивности. Антибиоплческую продуктивность мицелия — количество антибиотика, образуемое 1 мг биомассы за единицу времени (мкг/мг/ч), рассчитывают по формуле Аа -Аь ИМь + М„)/2~ г где Аь и А,, — количество антибиотика, мкг/мл; М,, и ̄— количество биомассы, мг/мл; г — время роста стрептомицета, ч. Результаты представляют в виде таблицы (табл.
30.2) и графика. 3. Выделение и идентификация аитибиотиков-актииомицииов. Проводят выделение сырца антибиотика из культуры стрептомицета и его хроматографирование. На хроматограммах проводят идентификацию антибиотика по Яд химическим реакциям, биологическому действию, сравнивая с 357 Таблица 302 Рост стрептомицета н образование антибиотика хроматограммой стандартного зтрепарата актиномицина. Определяют количество и относительное содержание компонентов в образовавшемся актиномицицовом комплексе, устанавливают зависимость этих величин от изменения среды, на которой растет стрептомицет, т.е.
эффект направленного биосинтеза. Выделение антибиотика. Оставшуюся после отбора 96-часовой пробы культуру стрептомицета выливают в делительную воронку. Туда же добавляют 20 — 30 мл этилацетата и легким встряхиванием проводят экстракцию актиномицинов в этилацетат. Когда слой этилацетата (верхний слой) становится ярко-оранжевым и свободным от пузырьков воды, его осторожно выливают в фарфоровую чашку. Необходима очень ти1ательна следить за прозрачнаспгыо слоя этилаиетата) Экстракцию можно провести 2 — 3 раза. Работа ведется в вытяжном шкафу.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
