А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 107
Текст из файла (страница 107)
7НзΠ— 0,1; ()ЧН«)зЗО« — 1,0; глюкоза— 2,0; !чаС! — 0,5; КС1 — 1 мг; вола билистиллироаанная; рН среды 6,8 — 7,0; режим стерилизации — 0,5 ати. КС1 добавляют а виде 0,02%-го распюра. Используют идеально чистую посулу, вымытую хромпиком, и реактиаы «осч», а раствор глюкозы предварительно обрабатьпакп актиаироаанным углем. Посевной материал Е сой 113-3 готовят а пробирках за сутки до засева опытной среды.
Для этого в 2 пробирки наливают по 5 мл опытной среды и по 5 мл стандартного раствора, содержюпсго а 1 мл 0,00005 мкг витамина Вп. Этот же раствор используют для приготовления стандартной кривой. Содержимое пробирок стсрилизуют при 0,5 ати а течение 20 мин и после охлаждения засевают культурой Е. сол 113-3 с агаризояанной среды. Засеянные пробирки ставят в термостат при 37 С на 16 — 20 ч. Затем отбирают 0,1 мл выросшей культуры и переносят а пробирку с 10 мл стерильного 0,9%-го раствора )ЧаС1.
Полученной суспензией Е. соя 113-3 засевают опытную среду в пробирках. Для получения калибровочной кривой применяют водный раствор витамина Вы, а 1 мл которого содержится 0,1 мкг витамина. В лень опыта его разводят до содержания 0,00005 мкг/мл, т.е.
в 2000 раз, и используют для анализа. Ход определения. В широкие пробирки (1,7 к 18 см) вносят по 5 мл опытной среды, добавляют раствор витамина Вп (0,5; 1,0; 1,5 и 2,0 мл) и доводят обьем а каждой пробирке до 1О мл дистиллированной ведой. На каждую концснтрапию витамина и контрольную пробу (без витамина) берут по 3 параллельные пробирки (асего 15 пробирок). При анализе опытных образцов вместо стандартного раствора витамина в пробирки вносят экстракт витамина Вп в количестве 0,5; 1,0; 1,5; 3,0 и 4,0 мл и также доводят общий обьем до 10 мл дистиллированной водой. Стандартные и испытуемые 365 образцы автоклавнруют 20 мин при 0,5 ати, охлаждают н засевают среды в пробирках одной каплей ннокулята Е. со!7 1!3-3. Засеянные пробирки инкубируют 20 — 24 ч прн 37 С. По окончании инкубации содержимое пробирок перемешивают.
Рост Е. соб 113-3 определяют нефелометрически при 400 нм. По полученным данным строят калибровочную кривую, откладывая на оси ординат среднее значение мутности для каждой концентрации стандартного раствора, а на оси абсцисс— абсолютное количество витамина Вп, содержащееся в данной пробирке. Содержание витамина опрсделяют отдельно в каждой пробирке испытуемого образца. По данным, которые уложились в стандартную кривую, определяют количество кобаламинов в испытуемом образце.
При этом учитывают, что при приготовлении экстракта культуру пропионовокислых бактерий разводили в 10 раз. Для определения содержания витамина необходимо рассчитывать нс менее 2 — 3 его разведений. Полученные данные о содержании витамина В и в биомассе пропионовокислых бактерий вносят в табл. 31.3. Магаеуиаяы, одоуудоваиив, посуда, уеаигаивы Пробирки — 30; пипетки на ! — 2 мл — 5; колбы на 500 мл; цилиндр мерный на 0,5 л„ баня водяная; ч ЭК; центрифуга; гвтатнв для пробирок; раствор витамина Вп в ампуле; 1ча1чО„реактивы лля приготовления сред.
План выполяеппя задачи Для выполнения задачи необходимо 20 ч. Занятие 1. Приготовление н стерилизация среды для определения витамина Вп. Подготовка среды лля Е. сой 113-3. Пересев тест-культуры Е. со!7 113-3 на среду за сутки до занятия 2. Занятие 2. Определение витамина Вп пробирочным методом.
Занятие 3. Оформление результатов задачи. Зачет. 3- ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА ВИТАМИНА В!я СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ Ход выполнения задачи Микроорганизм и его культивирование. Для проведения анализов нсобходимо 100 — 150 мл культуры Р.7геиг)епгеусгя! !см. с. Зб5). Метод заключается в отделении и промывке клеток бактерий с переводом кобаламинов в водный раствор путем гидролиза, воздействии светом на полученный гидролизат для перевода кобаламнна в оксикобаламин и определении оптической плотности при длине волны 530 нм. Оптическая плотность раствора пропорциональна содержанию кобаламина.
Чувствительность метода — 10— 100 мкг в пробе. Метод требует высокого содержания витамина в образце. Необходимо, чтобы в клетках содержалось не менее 0,1 — 0,2 % витамина на сухое вещество. Ход определения. Для анализа берут ! 00 — ! 50 мл культуры Р. 7геиделге1ейй, центрифугируют при 5 тыс. « 20 мнн. Супернатант удаляют, клетки промывают 3 — 4 объемами Збб Таблица 31.4 Количество витамина Вп, образованное пропионовокиелым бактериями, мкг/г биомассы дистиллированной воды, отделяя промывные воды центрифугированием в том же режиме.
Промытую влажную биомассу взвешивают и переносят количественно в колбу Эрленмейера с 30-кратным объемом дистиллированной воды, подкисленной 0,1 н, НС1 до рН 4,6 — 5,0. Полученную суспензию гидролизуют на кипяшей водяной бане в течение 40 мин. После охлаждения пщролизат центрифугируют, определяют значение рН и объем супернатанта. Гидролизат должен иметь рН 4,6 — 5,0. В случае подшелачивания его подкисляют 0,1 н. НС1. После этог о гидролизат помешают под лампу (60 Вт) на расстоянии 25 см и освещают в течение 30 мин. В случае выпадения осадка гидролизат фильтруют через бумажный фильтр.
Оптическую плотность раствора определяют на спектрофотометре при Х = 530 нм относительно дистиллированной воды. Содержимое кобаламинов (мкг/мл) в культу- ральной жидкости рассчитывают по формуле С=А„. !0" Ч56. Рп где Ано — оптическая плотность фильтрата, измеренная при длине волны 530 нм; У; объем гидролизата, мл; 56 — удельный показатель (коэффициент экстинкции) для оксикобаламина при 530 нм; Р; — количество культуральной жидкости, взятой для анализа, мл. Полученные данные о содержании витамина В и в биомассе пропионовокислых бактерий вносят в табл. 31,3.
Если образец исследуют несколькими методами, то результаты вносят также в обшую табл. 31.4. Материалы, оборудование, иоеуда, реактивы Пробирки — !О; пипетки на 1 — 2 мл — 5; 0,5 л; колба на 500мл; баня водяная; спектрофотометр; центрифуш; штатив для пробирок; лампа (60 Вт); раствор витамина В„в ампуле; реактивы для приготовления сред. План выполнения задачи Для проведения задачи необходимо 6 — 7 ч. Занятие 1. Определение витамина Вп спектрофотометрическим методом. Занятие 2. Оформление результатов задачи.
Зачет. ЗАДАЧА 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НИКОТИНОВОЙ КИСЛОТЫ Ннкотнновая кислота (витамнн РР, витамин В,, ннкотинамид, ниацнн) является пиридин-3-карбоновой кислотой, а никотннамнд — ее амндом. Оба соединения легко преврашаются друг в друга и поэтому обладают одинаковой витаминной активностью по отношению к живым организмам. Суточная по- 367 требность и витамине РР для человека составляет 20 — 25 мг. Источником витамина являются животные (мясо, печень) и многие растительные продукты— рис (не полированный), гречка, хлеб, картофель.
Делб дабол2и: определение содержания никотиновой кислоты в одном из продуктов питания (рис, гречка, мясо) микробиологическим методом. Ход выполнения задачи Микроорганизм н его культивирование. В работе используют тест-культуру л7иугеготускг глагх1ализ 734. Культуру дрожжей поддерживают на среде следующего состава: 7'Б сусло, агар 2%-й и водопроводная вода. Культивирование проводят в течение 48 ч при температуре 28 — 30 "С. Хранят дрожжи при 4— б 'С, пересевая не реже 1 раза в месяц.
Метод основан на определении интенсивности роста тест-организма — л'. таглаии 734, требующего для роста ннкотиновую кислоту, в жидкой среде. Интенсивность роста культуры зависит от количества никотиновой кислоты в образце. Для выявления витамина в исследуемом образце пищевого продукта необходимо предварительно подвергнуть этот образец экстракции. Для этого 1 г хорошо измельченного образца (рис, гречка, мясо) смешивают с 30 мл 1 н Нт8О, и автоклавируют при 1 ати в течение 15 мин. После этого гидролизат охлаждаю~, подшелачивают с помощью 1 н. р-ра 1л1аОН до значения рН 5,5 — 5,8 и доводят объем до 100 мл в мерной колбе дистиллированной водой. Содержимое мерной колбы фильтруют и при необходимости разбавляют ло содержания никопшовой кислоты в экстракте приблизительно ло 0,3 — 0,5 мкг/мл.
Перец определением витамина готовят посевной материал тест-культуры. Для этого небольшое количество биомассы суточной культуры К тагх1ализ вносят петлей в 10 мл Физиологического раствора. Мутность полученной суспензии лолжна быть незначительной.
Ход определения. Определение ведут в двух повторностях. Для этого в штативе расставляют 2 раца пробирок по б в каждом ряду. В каждую из пробирок разливают по 2 мл дистиллированной волы. Затем в первые пробирки ряда вносят по 2 мл раствора образца или стандартного раствора никотиновой кислоты при построении калибровочной кривой. В каждом ряду пробирок лелают 5 последовательных двукратных разведений, Таблица 31.5 Количество никотиновой кислоты в образце Зб8 перенося по 2 мл раствора из первой пробирки ряла в последующие.
После этого во все пробирки стерильно добавляют по 2 мл питательной среды Состава среди 1г/л): сахароза — 40,0; (ХН4)зБО4 — б,О; М8$΄— 1,4; ХаС! — 1,0; КН,РО4 — 2,0; К,НРО, — 0,2; тиамин хлорна — 0,002; пантотенат кальция — 0,002; пирилоксин — 0,0002; биотин — 0,000002. Вода дистиллированная, рН среды 5,5 — 5,7. Сахарозу и соли, используемые лля приготовления питательной среды, обрабатывают актиаированным углем. Для этого к 1ОО мл 20%-го раствора сахарозы или солей добавляют 5 г измельченного угля, помешают на круговукз качалку на 40 мин и фильтруют через бумажный фильтр.
Конечный обьем раствора в каждой из пробирок должен составлять 4 мл. В качестве контроля использукп. пробирку, содержащую 2 мл дистиллированной воды и 2 мл питательной срелы. Растворы а пробирках стерилизуют при 0,5 ати ! 5 мин, охлаждают и вносят посевной материал дрожжей по 1 капле в пробирку. Засеянные пробирки иикубируют 48 ч при 28 — 30 С. Интенсивность роста тест-культуры в пробирках со стандартными и исследуемыми растворами измеряют на ФЭК при длине волны 540 нм а кювете с длиной оптического пути 0,3 см. Для построения калибровочной кривой готовят стандартный раствор никотиновой кислоты. Для этого 0,01 г витамина растворяют в 20%-м этаноле в мерной колбе на 100 мл.
Из полученного раствора, содержащего 100 мкг/мл, готовят рабочий раствор, содержащий 0,4 мкг/мл никотиновой кислоты. Содержание витамина в ряду пробирок для калибровочной кривой должно составлять 0,.1; 0,05; 0,025; 0,0125; 0,00б25; 0,0031 мкг/мл. В качестве контроля используют дистиллированную воду. Полученные результаты вносят в табл. 31.5. Делают выводы о наличии никотиновой кислоты в образце. Материалы, оборудоваиие, посуда, реакпшвы Пробирки — 40„пипетки на 1 — 2 мл — 15; колбы на 500 мл; цилиндр мерный на 100 мл; ФЭК; штатив для пробирок; никотиновая кислота; актиаировапный уголь; реактивы для приготовления орел. План проведения задачи Для проведения задачи необхолимо 10 в 12 ч. Занятие 1. Приготовление и стерилизация среды ддя определения никотиновой кислоты.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
