А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 109
Текст из файла (страница 109)
Гены некоторых полифункциональных белков введены в состав рекомбинантных организмов. Так, например, Сгу-белки нескольких подвидов В. 1Ьяг(ля!еаза синтезируются картофелем, кукурузой, томатами и другими трансгснными растениями, защищая последние от вредных насекомых. В связи с этим изучение всех проявлений биологической активности полифункциоцальных белков, а особенно их антибиотического действия на микроорганизмы (важные компоненты природных биоценозов, прежде всего в почвах), необходимо для анализа и предотвращения возникновения возможных нежелательных экологичесюгх последствий расширяющегося внедрения трансгенных организмов в природные биоценозы. ЗАДАЧА.
ИЗУЧЕНИЕ ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫХ БЕЛКОВ БАКТЕРИЙ НА ПРИМЕРЕ СРУ-БЕЛКОВ ПАРАСПОРАЛЬНЫХ КРИСТАЛЛОВ ВА СШ ЦВ ТНУИИ6!ЕИЗ!е! йаМ ба~~; ~З"Ю «рй О М фз циональных белков на примере Сгу-белков параспоральных кристаллов В, 1!! ипил(епт. Ход выполнения задачи Микроорганизмы н их культивирование. В работе используют штамм эптомопатогенной бактерии В.
111иипрепяз тоьр. а!ех11, в состав параспоральных кристаллов которой входит один Сгу1А-белок. В работе может также быль выделена кристаллообразуюцгая бактерия из природного материала — почвы, трупа насекомого и т.п. Свойства белков ее кристаллов можно в таком случае сравнить со свойствами Сгу1Л-белка подвида а!пг11, и на основании такого сравнения 372 сделать предположение о природе белков, образующих параспоральные кристаллы выделенной бактерии. Для вьщеления кристаллообразующих споровых бактерий используют метод аиетатной селекции, сущность которого состоит в следующем. Образец природного материала помещают в 0,1 М раствор ацетата Иа, пастеризуют для убивания всгетативных клеток, затем помещают в термостат (30 'С) на сутки в питательном бульоне, например МПБ, на 0,1 н.
ацетате (рН 6,8) для прорастания всех спор, кроме спор кристаллообразующих бактерий, которые не прорастают в растворе ацетата. Затем убивгнот вегетативные клетки, образовавшиеся из проросших спор, также путем пастеризации и проводят высев суспензии, содержащей непроросшие споры кристаллообразуюших бактерий, на агаризованную картофельную среду (состав среды дан в приложении 4).
Отбирают среди выросших колоний колонию кристаллообразующих бактерий с помощью фазово-контрастной микроскопии или микроскопии окрашенных (для выявления кристаллов) красителем аналиновым черным или амидошварцем (см. приложение 6) препаратов. Затем выращивают выделенных кристаллообразующих бактерий так жс, как и а!ели; на жидкой картофельной среде с добавлением (г/л): Мп80» — 0,05; СаС1з — 0,08; М880» — 0,1; в 3 колбах на 750 мл с 200 мл среды на качалке при 220 об/мин и 30 С в течение 2 сут до завершения образования спор и кристаллов.
В качестве тест-культур используют Мк)ососсил 1игеил шт. 140 и 8ггерГотусез сЬузота!!их шт. 257. Выращивание микрококков, а также определение их чувствительности к антибиотическому действию белков кристаллов методом лиффузии в ащр проводят на агаризоеаниой среде следующего состава (г/л): КзНРО» — 7,0; КНзРО» — 2,0; цитрат натрия — 0,4; М88О» — 0,05; (!ЧН»)18О» — 1,0; НзО дистиллированная; рН 7,4. К среде добавляют 1 % трипказина («Ксана!«ч Венгрия) и 1,5% агара В(ге!г (О(Гсо, СШЛ). Эту жс среду, но без добавления агара используют при определении антибиотической активности белков методом микроразведсний.
Чувствительность стрептомицетов к антибиотическому действию белков кристаллов определяют на агаризованной среде Чапека с 2 % глюкозы. Выделение белков нз кристаллов бактерий. Суспснзию полученных кристаллов и спор отделяют центрифугированием (6000 8, 15 мин), промывают водой, 1 М ХаС1, 50%-м ацетоном и затем трижды водой, каждый раз центрифугируя. Кристаллы растворякп в течение 1 часа в 0,02 н. !ЧаОН при комнатной температуре при псремешивании. Супернатант отделяют центрифугированием (8000 я, 15 мин) и оставляют при комнатной температуре на 16 — 24 ч для активации протоксинов протеиназами, связанными с кристаллами.
После этого белки кристаллов осаждают ледяной уксусной кислотой при рН 4 — 5„немедленно центрифугируют с охлаждением (8000 8, 25 мин). Сгу-белки сразу растворяют в стерильном 0,01М трис-НС1 буферном растворе, рН 8,2 с 0,2 М КС1 (буфер К) и определяют концентрацию белка в растворе спектрофотометрически при 280 нм (евп).
При этом учитывают проведенные для ряда Сгубслков подсчеты, которые показали, что растворы этих белков с концентрацией 1 мг/мл имеют еззь = 1,6. Приготовление растворов белков для определения различных проявлений нх биологической активности в прнсугствнн и отсутствие различных сахаров.
Готовят по 5 мл растворов Сгу! А-белка, а также белков из крисгаллов выделенных бактерий в стерильном буфере К с концентрациями 400, 200, 100, 50 мкг/мл. 373 Для этого каждый из исходных растворов белков с определенной концентрацией разбавляют буфером К. Этот же буфер используют для приготовления всех разведений белков. Готовят по 4 мл 0,5 М растворов В-глюкозы, В-галактозы, Н-апетилглюкозамина, Х-ацетилгалактозамина в буфере К и смешивают их по 0,5 мл в соотношении 1: 1 с растворами белков кристаллов в этом же буфере так, чтобы конечная концентрация белка в полученных растворах составляла 50, 100, 200 и 400 мкг/мл, а каждого сахара — 0,25 М.
Оставляют при комнатной температуре на 1 ч, а затем используют для определения антибиотической, лектиноподобной, цитолитической активности этих растворов. Подготовка стерильных суспензий клеток тест-микроорганизмов. Микрококков и стрептомицетов выращивают в течение суток на агаризованных вышеуказанных средах в 3 и 5 чашках Петри соответственно. Затем снимают стерильной петлей клетки с поверхности агара на этих чашках, помещают в стерильные центрифужные стаканы с крьпнками на 50 мл с 30 мл стерильной воды, тщательно гомогенизируют путем взбалтывания и оставляют при 4 'С на 1 — 2 сут.
После этого клетки отделяют центрифугированием при 6 тыс. я, в течение 15 мин и готовят суспензии клеток в стерильных питательных средах для определения чувствительности к антибиотическому действию изучаемых белков. Для всех определений в этой задаче требуются химически чистые реактивы и высокоочишснный агар производства фирм «131Гсо» (США) или «Гсгай (Германия). Определение аитибиотической активности полифункциональных белков.
Определение антибиотической активности белков методом микроразведений проводят в стерильных иммунологических плашках. В каждую из углублений (лунок) в плагпке вносят по 80 мкл суспензии клеток микрококков в жидкой среде (примерно 103 клеток/мл), указанной выше, смешивают с изучаемыми растворами белков и белков с сахарами так, чтобы конечная концентрация белков составила а жидкой суспензии 5, 10, 20, 50 и 100 мкг/мл, а конечный объем жидкости во всех лунках был одинаковым — 100 мкл. Немедленно измеряют поглощение клеточной суспензии с растворами белков, а также с соответствующими контролями (буфер К, растворы сахаров в буфере К), на многоканальном плашечном спектрофотомстре Пп)Папа (или другом подобном приборе) при Х = б00 нм.
Затем (через 2 ч при комнатной температуре) плашки помещают на 30 С и вновь измеряют изменение поглощения клеточной суспензии на плашечном спектрофотометре через 2, 5 и, если необходимо„20 ч. Минимальной ингибирующей концентрацией при всех определениях антибиотической активности является наименьшая концентрация белка, подавляющая рост тест-микроорганизмов. Для сравнения определяют антнбнотнческую активность изучаемых растворов методом диФФузии в агаре.
Газоны тест-микроорганизмов в вышеуказанных средах готовят общепринятым способом, разливая агарнзованную среду с суспензней клеток на лотки тонким ровным слоем. Делают а агар« лунки диаметром б см специальным сверлом. А~арнзованные среды с клетками подсушивают в ламинаре црн продувке в течение 1Π— 15 мнн и немедленно вносят в лунки по 20 мкл всех приготовленных растворов белков, белков с сахарами н соответствующие контроли, оставляют закрытые лотки прн комнатной температуре для диффузии растворов на 12 — 20 ч.
Затем помешают лотки в термостат на 30 С н измеряют зоны подавления роста мнкрококков через сутки, а стрептомнпетов — через 2 — 3 сут. 374 Определение агглютииируницей способности белков кристаллов в присутствии и в отсутствие сахаров. Гемагглютипируюшую активность изучаемых растворов белков определяют реакцией гемагглютинации с самопроизвольным оседанием эритроцитов. Метод основан на явлении осаждения эритроцитов со скоростью, пропорциональной концентрации агглютипинов. Степень агглютинации оценивают нефелометрически измерением плотности слоя неосевших эритроцитов при Х = 600 нм. Дополнительно контролируют под световым микроскопом вид осевших эритроцитов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
