А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 112
Текст из файла (страница 112)
Для каждого анализа с помощью газового шприпа на 0,5 — 1,0 мл берут пробу газа 0,2 мл. При температуре термостата колонок 50 С пик водорода регистрируется через б5 с, метана — через 112 с, СОз — через 185 с. 381 Количество газа (моль/л) рассчитывают следующим образом: С= Л/Г Р/Рр Тр/Т Р;/)'„, где 2) — содержание данного газа в газовой фазе, об. %; )'и — объем 1 моля газа; Р— давление в сосуде, ат; Рп — давление при нормальных условиях (1 ат); Т,— температура при нормальных условиях (273 К); Т вЂ” температура культивирования, К; )т, — объем газовой фазы в сосуде; )т„— объем жидкой фазы в сосуде. Величину В рассчитывают по высотам хроматографических пиков, так как они довольно узки (обычно расчеты делают по площадям поверхности под пиком): высоту пика для данного газа (мм) делят на 100 и на тангенс угла наклона калибровочной кривой.
При проведении расчетов следует учитывать чувствительность прибора при измерении данной пробы. Калибровочные кривые получают следующим образом: флаконы емкостью 10 мл заполняют аргоном и закрывают их герметично резиновыми пробками, предусматривающими отбор проб газа. В эти флаконы газовым шприцем добавляют нужный объем анализируемого газа, чтобы его содержание составляло 0,5 — 96 % для метана, 0,5 — 100 % — для водорода и 1 — 100 % — для углекислого газа.
Из каждого флакона отбирают 3 пробы по 0,2 мл и фиксируют высоту хроматографического пика для анализируемого газа. Полученные данные усредняют и осуществляют построение калибровочной кривой в координатах: содержание газа (об. %) соответствует высоте пика (мм). Определение адетата и других летучих жирных кислот (ЛЖК) и спиртов. Интермедиатами анаэробного распада азокрасителсй и ароматических аминов являются ЛЖК и спирты с длиной углеводородного скелета не более 6 атомов, концентрацию которых определяют на газовом хроматографе «Сйгош-5» с пламенно-ионизационньгм детектором, на колонке 1 и, заполненной хромосорбом 101.
Скорость газа-носителя (аргона) — 30 мл/мин. Для каждого аначиза берут пробу жидкой фазы 1 мкл, подкисленную соляной кислотой. При температуре термостата колонок 200 С происходит четкое разделение продуктов, идентифицируемых по временам удержания соответствующих соелинений в стандартных растворах. Расчет котщентрации каждого вещества (мМ) проводят по высоте пика, отнесенной к высоте пика этого вещества в сгандарпюм растворе: ттпр т ' прСст т~стдст где л — высота пика в пробе или стандартном раппюре; Ат — чувствительность прибора при соответствующем измерении; С вЂ” концентрация вещества в соответствующем растворе. Определение концентрации ароматических интермедиатов и продуктов нх дальнейшего преобразования.
Исходя из химической формулы азокрасителя, возможного пути его фрагментации и максимумов поглощения пиков продуктов при спектрофотометрическом сканировании, подбирают в качестве стандартов соответствующие амины и другис ароматические соединения. Идентификацию веществ и определение их концентрации проводят при помощи метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе Пи Ропг (США), используя колонку с обращенной фазой (Диасорб 130-СмТ, 6 мкм) в системе уксусная кислота (1%) — метанол (в соотношении 85: 15 по объему). В качестве детектора используют спектрофотометр, на- счроенный на длину волны 225 нм (средняя длина волны поглощения ароматических соединений).
Скорость подачи элюента 1 мл/мин, давление 148 ат. Объем вводимой пробы 20 мкл. До проведения анализа отобранные пробы могут храниться при -20 С н течение 30 сут в закрытых пластиковых пробирках Эппендорф. Ароматические вещества определяют по соответствию их времен удержания временам удержания стандартных растноров, а расчет концентрации компонентов смеси ведут по площадям пиков, от!!сесиным к площадям пиков веществ в стагщартных растворах. Определение концентрации иона аммония. Концентрацию ионов аммония определяют по методу Фоссета и Скотга.
Для этого готовят реактив Фоссво~а, состоящий из двух растнорон. Раствор А (г/л): фенсл — 10; нитропруссид натрия — 0,05. Раствор Б(г/л): Ха,НРО4 — 37; 14аОН вЂ” !О, 1%-й раствор гипохлорита натрия ()чаОС1) — 1О мл. Для определения концентрации аммония н жилкой фазе 200 мкл исследуемого раствора помещают н мерную пробирку, разбавляют водой до 400 мкл, затем добавляют 0,8 мл раствора А и 0,8 мл раствора Б и интенсивно перемешивают. Растворы инкубируют 30 мин при 37 'С, а затем сразу измеряют оптическую плотность при 578 нм и! = 1 см.
В качестве контроля используют раствор, не содержащий аммония. По калибровочной кривой (от 1 до 15 мг/л о!Н') определяют содержание аммония в исследуемом растворе. При необходимости растворы А и Б можно хранить н сосудах из темного стекла не более 2 мес. Определение концентрации сульфида. Исходный азокраситель содержит н своем составе сульфогруппу, поэтому можно ожидать появления иона сульфида в процессе анаэробной биодеструкпии. Концентрацию сульфид-иона определяют по методу Трюпера и Шлегеля с использованием трех распюрон, содержащих в 100 мл каждого раствора: раствор А: ацетат цинка — 4 г, ледяная уксусная кислота — 0,05 мл; раствор В: 2-диметил-а-фенилендиаминсульфат — 0,2 г; Н280д (конц.) — 20 г; раствор С: Ге()ЧНБО„)~ — 10 г, Нз80, (конц.) — 2 г. К 100 мкл раствора А н пластиковой пробирке Эппендорф быстро добавляют 10 мкл пробы и 785 мкл дистиллированной воды.
Затем в смесь вносят 100 мкл раствора В и 5 мкл раствора С. Через 10 мин измеряют поглощение образовавшегося хромогенного комплекса при ббО нм и 1= 1 см. По калибровочной кривой (от 100 до 500 мкг/мл 82 ) определяют содержание суль4нща н исследуемом растворе. В качестве контроля используют воду. Определение белка. Прирост биомассы микроорганизмов оценивают по обгдему содержанию белка в среде, которое определяют методом Бредфорд (см. гл. 14). Для анализа отбирают пробу жидкой фазы объемом 0,3 мл, центрифугируют н течение 15 мин при 12 тыс.
8, удаляют налосадочную жидкость. К осалку добавляют 0,3 мл щелочи (3 Х )чаОН) и выдерживают при 30 'С н течение ! 2 ч. При определении содержания белка н пробирки вносят по 200 мкл пробы, добанляют по 2 мл реактива Бред- форд, перемешивают и через 20 мин измеряют оптическую плотность при Х = 595 нм. Пгшьзунсь калибровочной кривой, определяют концентрацию белка н исследуемых растворах.
Калибровочную кривую строят, используя бычий сынороточный альбумин, высушенный н эксикаторе до постоянного веса, из которого готовят растворы с концентрацией белка от 1О до 100 мкг/мл. Затем растворы обрабатывают, как было описано выше, и строят зависимость оптической плотности от концентрации белка. Микроскопия. Для итализа изменений микроскопической картины микробного сообщества готовят фиксированныс окрашенные препараты и просматривают их с иммерсионной системой под световым микроскопом.
Условия проведения экспериментов. На предварительном этапе работы рассчитывают необходимые количества реактивов для приготовления концентрированных растворов. При этом следует учитывать, что итоговая концентрация 383 субстратов и добавок в средс должна вюпочатгв пируват натрия — 3 мМ; ацетат натрия — 6 мМ; бромэтансульфоновая кислота — 45 мМ и азокраситель в разных вариантах опыта — 0,7; 1,4; 2,1; 2,8 и 3,5 мМ. Каждая добавка должна быть внесена в обьсме, не превышающем 1 мл. Снимают полный спектр раствора азокрасителя (концентрация 300 мг/л) в диапазоне длин волн 200 — 600 нм (рис. 33.4). Затем осуществляют построение калибровочных кривых для всех измеряемых соединений.
В пузырьки со средой стерильно вносят активный ил из расчета 10% по объему и необходимые добавки. В качестве контрольных используют варианты: ~ пузырьки без активного ила с добавлением азокрасителя в концентрации 0,7 мМ для регистрации возможных физико-химических преобразований субстрата в минеральной среде (без участия биологической активности); ° пузырьки без красителя, но с активным илом для учета выделения метана за счет лизиса инокулята: ° флаконы, содержащие ил, предварительно инактивированный автоклавированием при 0,5 ати, для выявления роли адсорбции азокраситсля на матрикс ила. Полный набор вариантов опыта представлен на рис.
33.5. Каждый вариант ставят в двух повторностях. Культивирование во всех вариантах проводят в стационарных условиях (без перемешивания) в темнотс при 30'С. Отбор проб жидкой (0,8 мл) и газовой (0,2 мл) фаз осуществляют в нулевой точке и каждые 24 ч (48 ч) стерильными шприцами, без нарушения анаэробиоза. В эксперименте по биоразлагаемости сравнивают изменение концентраций азокрасителя, промежуточных (Нь ароматических аминов, ацетата и других ЛЖК и спиртов) и конечных (метана, углекислоты, аммония и сульфида) продуктов, а также прирост биомассы в опытном и трех контрольных вариантах.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
