А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 114
Текст из файла (страница 114)
Клеточная стенка К- варианта в 1,5 — 2 раза толще, чем Б-варианта. Морфологические особенности деления можно связать с химическим составом и электрозаряженностью вещества капсул (при отрицательных зарядах возникает отталкивание оболочек). У диссоцяантов разное количество ненасыщенных липидов в мембранах, что влияет на ее текучесть (у К-варианта обнаруживается больше липидов, содержащих больше насьпценных кислот). Различия в клеточных оболочках приводят к разной скорости поглощения и экскреции веществ, активности мембранных ферментов, что в свою очередь влияет на изменение скорости роста, выделения продуктов, устойчивости к токсическим веществам. Свойство диссоциации важно учитывать при проведении процессов в микробиологических производствах. При культивировании медленно растущие варианты вытесня- 337 Таблица 34.1 Селективиые преимущества (ббльшая устойчивость) диссоциавтов ряда мезофильиых грамположвтельиых и грамотрицательиых бактерий при воздействии различных факторов ются быстрорастущими, но, как правило, менее активными диссолиалтами.
У диссоциантов различаются не только количество, но и состав биологически активных веществ. Условия культивирования оказывают существенное влияние на состав популяции. Если один диссоциант имеет преимущество, то к концу цикла состав популяции может полностью поменяться. Табл. 34.! дает представление о селективных лреилущесювах диссоциантов при воздействии различных факторов. Таким образом, можно сказать, что диссоциация — это адалтщ!ия к меняющимся условиям среды на уровне популяции. Показано, что в создании гетерогенности микробной популяпии в результате процесса диссоциации играют роль все генетические процессы — трансформация, трансдукция, фаговая конверсия, мигрирующие генетические элементы (умеренные фаги, плазмиды, транспозоны), а при получении культуры из одной клетки — только мигрирующие генетические элементы генома одной клетки. Для стабилизации синтеза биологически активных веществ в промышленности необхолимо: !) получить недиссоциирующий клон„2) вести стабилизирующий отбор; 3) соблюдать оптимальные условия хранения; 4) соблюдать оптимальные условия роста высокопродуктивного диссоцианта.
Знания о диссоциации позволяют прогнозировать течение процесса и дают возможность им управлять. По систематическому положению диссоцианты определяются как один вид, так как в определителе дается признак по принципу «есть-нет», а диссоциация лает изменения по принципу «больше-меньп|е». ЗАДАЧА. ДИССОЦИАЦИЯ У РВЕУОО)ИОг(АВ АЕВУС!ИОВА К-2 И ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА ЭТОТ ПРОЦЕСС Бактерии рода Рхеиь!отопиз являются настоящими космополитами, обладают способностью к существованию в самых разнообразных условиях и встречаются на Земле повсеместно. 388 Разнообразие метаболитических возможностей, высокая скорость роста на простых средах и особенности организации генетического аппарата делают псевдомонад привлекательными и перспективными для биотехнологии объектами.
Представители рода Рхеаг7ооюпиз используются для получения ряда игцшвидуальных химических веществ, в производстве препаратов для сельского хозяйства, полимеров„в биогицрометаллургии, в нефтедобыче — для повышения отдачи пластов, а также при переработке и удалении отходов и веществ, загрязняющих окружающую среду, в том числе и углеводородов. При расссве псевдомонад на плотныс среды, как правило, обнаруживаются К-, 8- и М-диссоцианты, различающиеся рядом физиолого-биохимических признаков, ультратонким строением клеток, морфологией колоний„скоростью роста, устойчивостью к действию ряда химических и Физических Факторов.
Диссоцианты Р. аегияагоха К-2 различаются: 1) размером и строением колоний — самые большие и прозрачные колонии образует М-диссоциант, клетки которого обладают мощной капсулой; В.-диссоциант растет в виде небольших плотных колоний, так как его клетки имеют тонкую капсулу; 2) потребностями в основных биогенных элементах (углероде, азоте и Фосфоре) — К-клетки лучше растут на богатых средах, а М-клетки имеют селективные преимущества на средах с недостатком азота или фосфора; 3) пугями использования глюкозы — у К-диссоцианта преобладает окислительный путь, а М-клетки наиболее активно осуществляют превращение сахара с образованием муравьиной кислоты, что приводит к резкому подкислению среды.
8-диссоциант способен переключаться с одного из вышеуказанных способов использования глюкозы ца другой. ,„, . »«У» У тивирования на расщепление популяции Р. исгиягпгма К-2 на лиссоцианты и описание ряда морфофизиологических признаков полученных вариантов. Ход выполнения задачи Микроорганизм. В работе используют 8-диссоциант непатогенпого штамма Р.
аегаяглоза К-2, выделенного из пластовых вод сибирского нефтяного месторождения Ван-Бган. Среды н растворы. В качестве богатой среды применяют бульон-сусло-агар (БСЛ), рН 7,0. Для приготовления среды к МПБ добавляют неохмеленное сусло (6'Б) и 1,5% агара. Среду стерилизуют при 0,5 ати. Минеральную среду применяют в двух людификациях: а) полноценная следующего состава (г/л): КС1 — 0,6; КИОТ вЂ” 5,0; )л)аН2РО«2Н,Π— 0,5; М880«7Н20 — 0,2, рН 7,0; б) «голодная по фосФору» — )ЧаН2РО«2Н20— 0,05.
Среду стерилизуют при 1,0 ати. После стерилизации вносят 2,0 % глюкозы в виде 40%-го раствора, простерилизованного при 0,5 ати. Для приготовления суспснзий клеток и десятичных разведений готовят стерильный Физиологический раствор (0,85%-й 1л(аС! в дистиллированной воде, стерилизация при 1,0 ати). Общая схема эксперимента (рис. 34.1). Для получения исходной суточной культуры осуществляют посев петлей из выданных преподавателем пробирок с 8- диссоциантом Р. аегарпохи К-2 на свежий скошенный БСЛ (выдаются лаборан- 389 том) и инкубируют засеянные пробирки при 30 'С в течение 24 ч. В стерильную узкую пробирку наливают пипеткой стерильный физраствор (-3 мл), куда осторожно переносят петлей выросшие бактерии, не захватывая БСА, энергично перемешивают и доводят плотность суспензии стерильным Физраствором до концентрации 10У клеток в 1 мл, сравнивая ее с соответствующим стандартом лблггггосгпи.
Общее количеспю получившейся суспензии должно быть не менее 7 мл. 3 сут Инкубация 2 сут при 30 'С Инкубация 2 сут при 30 'С Рыс. 34.1. Схема эксперимента по диссоциацин Я-варианта Р. аегзягггода 390 минеральная по фосфору» среда минеральная среда Инкубация при 30 С на качалке 200 об/мин Полноценная минеральная среда Инкубация 1 суг ' при 37'Сна Из части суспензии (0,5 мл) готовят десятичные разведения в стерильном физрастворе до 10 ', вносят по О,! мл в чагпки с БСА из разведений 10 ' — 10 з (в трех повторностях) и тщательно растирают стеклянными шпателями.
Инкубируют засеянные чашки в течение 2 сут при 30 С, после чего до подсчета колоний хранят в холодильнике до 5 сут. Из оставшейся суспензии производят посев в жидкие минеральные среды в широких пробирках (по 10 мл) и круглодонных колбах (по 50 мл), внося по 3 % (по объему) посевного материала. Каждый вариант опыта ставят не менее чем в трех повторностях. Культуру инкубируют в колбах при 37 'С на качалке при 300 об/мин в течение суток, а в пробирках при 30 'С на качалке при 200 об/мин на полноценной среде — 2 сут, на «голодной по фосфору» — 3 сут.
Готовят десятичные разведения усредненных проб в стерильном физрастворе до 10' ' и вносят по 0„1 мл из трех последних разведений в чашки с БСА (в трех повторностях). Суспензию тщательно растирают по агару стеклянным шпателель Засеянные чашки инкубируют при 30 'С в течение 48 ч.
Культуры в жилких средах до рассева и чашки с выросшей культурой до подсчета колоний можно хранить в холодильнике до 5 сут. В культуральной жидкости всех вариантов в усредненной пробе определяют оптическую плотность и рН. Результаты вносят в табл. 34.2. На чашках подсчитывают общее число колоний и число колоний каждого морфотипа. Описывают имеющиеся типы колоний. Определяют долю лиссоциантов в разных вариантах опьпа. Результаты вносят в табл. 34.2.
Делают выводы о влиянии состава среды„температуры и аэрации на гетерогенность популяции исходной культуры. Соотносят наблюдаемый сдвиг рН с увеличением доли определенного диссоцианта. Чашки с колониями М-диссоцианта оставляют на хранение при комнатной температуре на 1 мес. После этого колонию снимазот петлей с агара, суспендируют в стерильном физрастворе, делают десятичные разведения до 10 з и рассевают обычным способом на чашки с БСА из четырех последних разведений (в двух повторностях).
Инкубируют 2 сут при 30 С, Подсчитывают общее число колоний и долю диссоциантов в популяции. Делают вывод о влиянии активности воды на расщепление культуры на диссоцианты. Т а б л и и а 34.2 Состав популяции Р. аееихтоза К-2 при разных условиях культивирования 391 Материалы, вбарудова>те, посуда, реактивы Качалки 200 и 300 об/мин (30 и 37 'С); рН-метр; спектрофотомстр; стандарт мутности (10~ клеток/мл); счетчик колоний; микробиологическая петля. Чашки Петри — 55; пробирки узкие с ватными пробками — 40; пробирки широкие с ватными пробками— 10; стеклянные шпатели — 10; пипетки на 1 мл — 45; на 5 мл — 5; на 10 мл — 1; круглодонные колбы на 250 мл — 3. БСА — 1 л; жидкие минеральные среды: полноценная — 0,2 л в 3 широких пробирках по 10 мл и в 3 круглодонных колбах по 50 мл; «голодная по фосфору» — 50 мл в 3 широких пробирках по 10 мл; 40%-й раствор глюкозы — 50 мл, физиологический раствор — 0,3 л, скошенный БСА в пробирках— 2 шт.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
