А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 117
Текст из файла (страница 117)
Наиболее распространены среды, содержащие какой-либо углевод (например, лактозу) и индикатор изменения кислотности среды (хлорнд трифенилтетразолия, эозин-метиленовый синий, индикатор Мак-Конки и др.). На среде с лактозой и трифенилтетразолием клетки Е со!1, использующие лактозу, образуют кислоты и понижают рН. При низких значениях рН восстановления трифенилтстразолия не происходит и колонии имеют нейтральный белый цвет. Колонии, сосзояцше из клеток, не способных использовать лактозу, имеют ярко-красную окраску. Напротив, на среде с индикатором Мак-Конки, содержащей лактозу, колонии, клетки которых способны использовать ее, приобретают темно-красный цвет.
Клетки, не способные использовать лактозу, образуют колонии белого цвета. Применение индикаторных сред пригодно для поиска любых мутантов, если имеется возможность различать колонии мушнтов по изменению их окраски. С помощью индикаторных сред можно„например, выявлять мутанты по фосфатазной, нуклеазной или прогеолитической активности. Важной особенностью метода индикаторных сред является подбор о~ ~тимального разведения культуры при посеве на агарнзованные среды. Количество колоний на чашке не должно бьггь слишком большим (обычно не более 100), иначе фенотипы соседних колоний (например, из-за подкисления среды) могут быть выражены нечетко.
Второй тип индикаторных сред содержит специальные хромогенные субстраты, несущие в своей молекуле группировку, освобождающуюся при гидролизс и придающую окраску колонии, клетки которой обладают активностью по отношению к такому субстрату. Хромогенные субстраты либо просто добавляют в среду, либо опрыскивают нми среды в чашках после того, как на них выросли колонии. В качестве хромогенного субстрата широко используют Х-яа1 (5-бром-4-хлор-З-индолил-б-П-галактозид), с помощью которого обнаруживают наличие б-галактозидазы, одного из ферментов, необходимых для утилизации лактозы.
Клетки, синтезирующие б-плактозидазу, расщепляют Х-яа! с образованием 5-бром-4-хлор-индиго, который окрашивает колонии в ярко-синий цвет. ° Мегпод отпечатков, или реплик, — олин из широко используемых способов выявления мутантов. Он заключается в получении отпечатков колоний, выросших на полноценной ашризовш<ной среде при посеве обработанной мутагеном суспензии микроорганизмов, на чашках с селсктивными срелэми. Это позволяет выявить колонии, растущие на полноценной среде, но не растущие на какой-либо селективной среде, которые и проверяют па наличие мутаций. Наиболее удобно использовать тканевый репликатор (рис. 35.1).
На цилиндрическую болванку (3) натягивается бархатная ткань (1) и закрепляется металлическим кольцом (2). Прикасаясь стерильным репликатором к колониям в исходной чашке, получают отпечатки колоний па ~кани (1). Затем прижимают репликатор к поверхности разных селективных сред последовательно в 10 чашках, при этом сохраняется расположение колоний относительно друг лруга. Рис. 35.2. Игольчатый репликатор Рис. 35.1. Тканевый репликатор (см.
текст) При использовании. игольчатого репликатора (рис. 35.2) сначала делают отпечатки его циллиндрических иголок на поверхности стерильной агаризованной полноценной среды, не повреждая агар. Затем с помощью стерильных спичек или заостренных полосок толстой бумаги переносят на следы иголок клетки из колоний, выросших из суспензии культуры, обработанной мутагеном. Когда на следах иголок образуются колонии, с помощью того же репликатора делают отпечатки на ряд селективных сред. При отсутствии репликкгоров можно осуществлять перенесение клеток из колоний, выросших при рассеве обработанной мутагеном культуры, стерильными спичками или заосгреннымн полосками бумаги на агаризованные среды в чашках, дно которых расчерчено по трафарету на пронумерованные квадраты.
Одной спичкой (полоской) прикасаются к нужной колонии, а затем последовательно к поверхности пара в чашках с селективной и полноценной средой в квадратах с одним номером. Этот способ, конечно, более трудоемкий и занимает больше времени, однако позволяет достичь аналогичного результата без применения специальных инструментов. Пенициллиновый метод обогащения мутантов.
Возникновение мутаций даже при их индукции сильными мутагснами — относительно редкое собьп не. При прямых методах селекции это обстоятельство не играет существенной роли, поскольку с помощью селективных сред элиминируются все немутантные клетки. Фактором, ограничивающим разрешающую способность непрямых методов отбора, является низкая частота возникновения мутаций (даже когда они индуцированы сильным мутагеном), так как поиск мутантов приходится проводить на значительном фоне колоний дикого типа.
Для повьппения доли мутантных клеток в популяции используют метод обогащения, элиминируюший значительное количество немутантных клеток. При работе с бактериями чаще всего используют пенициллиновый метод. Как известно, этот антибиотик подавляет синтез пептидогликана клеточной стенки, что приводит к гибели активно растущих клеток. Если обработанную мутагеном культуру выращивать на минимальной среде, то размножаться и расти будут только клетки дикого типа (прототрофы). Именно они и подвергнутся воздействию внесенно~ о в такую среду пенициллина и погибнут, а количество мутантных (ауксотрофных) нерастущих клеток не изменится. Таким образом, доля мутантов в популяции увеличится, т.е. произойдет орюгащение популяции мутантными клетками. Для успешного проведения процедуры обогащения обрабатывать пенициллином следует культуру, проинкубированную в минимальной среде в течение 3 — 4 генераций для истощения у мутантных клеенок эндогепных метаболитов, за счет которых возможны их росз.
в среде с пенициллином и обусловленная этим гибель. Обрабатываемая антибиотиком суспензия не должна быль густой (до 1О' клеток/ьш), так как продукты лизпса погибших от пенициллина клеток могут поддерживать рост мутантных клеток и то~да они также подвергнутся действию этого антибиотика. Если придерживаться оптимальных условий, то можно достичь 1000- кратного обогащения популяции мутантами. 399 Перенос генетической информации у бактерий Наследственную изменчивость у прокариотическгт микрооршнизмов вызывают рекомбинации генетического материала трех основных типов: трансгрармацил, каныагация и трансдукция, широко используемые в генетических экспериментах.
Трансс~юриацией называют процесс переноса генетической информации, в результате которого экзогенная ДНК проникает в реципиентную клетку и вызывает ее наследственные изменения. При этом ДНК может представлять весь донорный геном либо его часть. Передачу в клетку целого генома фага, приводящую к образованию в ней зрелых фаговых частиц, называют транефекцией.
По с~юсобу переноса ДНК в бактсриальную клетку этсг процесс является трансформацией, однако в отличие от последней в результате трансфекции происходит лизис клетки, а не ее наследственное изменение. Каньюгация — процесс переноса генетической информации из клетки-донора в клетку-реципиент, который осуществляется при их непосредственном контакте между собой.
Трангдукция — перенос генетической информации из клетки-донора в клетку-реципиент, осуществляемый фагом. Общим свойством всех трех процессов является их однонаправленность, т.е. одна клетка всегда выступает в роли донора ДНК, а другая — в роли реципиента. Взаимного (рецнпрокного) обмена генетической информацией у бактерий не происходит. В экспериментальной работе наиболее часто используют методы„основанные на процессах трансформации и конъюгации. Трансформация Трансформагшя может осуществляться как хромосомной, так и плазмидной ДНК.
Реципиентная клетка„в которой происходит экспрессия генетического материала донора, называется трансформантан. Важное условие способности клетки к трансформации — развитие у нее особого физиологического состояния — каинетентнастга По развитию состояния компетентности микроорганизмы можно разделить на три группы: 1) компетентность возникает лишь в определенной фазе роста культуры (например, стрептококки, бациллы); 2) клетки компетентны в любой фазе роста (например, гонококки, менингококки); 3) естественная компетентность отсутствует, и клетки становятся компетентными только после специальной обработки (например, клетки Г.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
