А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 119
Текст из файла (страница 119)
Трехролительские скрещивания обладают рялом преимуществ по сравнению с двуролительскими. Прежде всего отпалает необходимость конструировать доиорный штамм, содержащий две плазмицы. Кроме того, трехролительские скрещивания позволяют преололеть барьер несовместимости, когда мобилизуемая и мобилизующая плазмиды относятся к одной группе несовместимости. Постановка скрещивания. Существует несколько способов скрещивания бактериальпых штаммов при помощи конъюгации: в жсидкай среде, на поверхности питательного агара, на мембранных грильтрах. Выбор способа скрещивания определяется типом конъюгативной плазмиды и целью эксперимента. Самым простым способом является скрешпвание в жидкой среде.
В этих условиях с высокой эффективностью происходит скрешивание, обусловленное половым фактором Р и родственными ему плазмидами. Однако этот метод имеет ограниченное применение, поскольку многие плазмиды детерминируют образование коротких пилой (например, плазмиды Р-группы несовместимости), которые в условиях жидкой среды не обеспечивают тесного контакта между клетками. Для создания такого контакта скрещивание проводят непосредственно в чашке с агаризованной питательной средой или на мембранном фильтре, помещенном на поверхность агаризованной питательной среды. Послелний способ более удобен в случае, когда необходимо провести одновременно несколько скрещиваний. Для скрещивания используют мембранные фильтры, задерживающие микроорганизмы, т.е. с диаметром пор 0,45 или 0,22 мкм.
Детальное описание основанных на конъюгации экспериментов для генетического анализа у бактерий можно найти в специальной литературе. Пиже приведена общая методика постановки конъюгации на примере мобилизации неконъюгативпой плазмиды КЯГ1010 конъюгативной плазмидой 1чР1. Родительские штаммы микроорганизмов, используемые в скрещивании, должны различаться между собой генетическими маркерами, например маркерами ауксотрофности или устойчивости к антибиотикам. В случае Е.
са11 одним штаммом может бьггь, например, С600 (туг, !ец „1Ы ), а другим — 353 (рго, ше1 '). Допустим, что один из штаммов С600 содержит коцъюгативную плазмиду В.Р1 (кодирующую устойчивость к ампициллину, тстрациклину и канамицину), а второй штамм С600 содержит неконъюгативную плазмицу КЯГ1010 (кодирующую устойчивость к сульфаниламидам и стрсптомицину), которую нужно передать в штамм 153.
Для скрещивания используют молодые, активно растущие культуры, причем концентрация реципиентных клеток должна значительно (примерно в 10 раз) превышать концентрацию донорных клеток. С этой целью ночные культуры 403 всех трех штаммов Е. сой (выращивать можно без аэрации) разводят примерно в 5 раз теплой средой 1 В и подращивают в течение 90 — 100 мин. Затем в пробирке (удобно использовать пробирки Эппендорф) смешивают по 20 мкл донорных культур, т.е. штаммов с плазмидами КР1 и КЗГ1010, и 0,1 мл культуры реципиента. Растирают смесь шпателем по поверхности агаризовапной среды 1.В и чашку инкубируют при 37 С в течение 3 ч. По окончании скрещивания клетки смывают шпателем с поверхности агара 2 мл физраствора и делают десятикратные разведения коцъюгационной смеси в физрастворе до 10 ~.
Затем пробы по 0,1 мл из разведений 10 ' и 10 ч высевают на чашки с селективными срелами. Одна чашка должна содержать селективную среду с одним из антибиотиков лля отбора трансконъюгантов, получивших плазмиду КР1 (канамицин— 50 мкг/мл, тетрациклин — 20 мкг/мл, ампициллин — 100 мкг/мл), другая — со стрептомиципом (50 мкг/мл) для отбора транскопъюгантов, получивших плазмиду КЯГ1010. В качестве основы для селективной среды используют минимальную среду А (с добавками пролина и мстионина), на которой могут расти только клетки штамма 353. В качестве контроля на селективные чашки засевают по 0,1 мл культур родительских штаммов, чтобы убедиться в неспособности клеток этих штаммов образовывать колонии на селективных срелах. Засеянные чашки помещают в тсрмостат при 37 С на 48 ч.
По окончании ишсубации проводят подсчет трансконъюгантов в чашках с сслективными средами. Частота мобилизации неконьюгативнай плазмиды КЗГ!010 определяется как опгошсние количества трансконъюг антов, получивших маркер нсконъюгативной плазмиды, к количеству трансконъюгантов, получивших маркер копъюгативной плазмиды. ЗАДАЧА 1. ЛЕТАЛЬНОЕ И МУТАГЕННОЕ ДЕЙСТВИЕ УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫХ ЛУЧЕЙ (УФЛ) НА КЛЕТКИ ЕВСНЕВIСН!А СО1.! Ультрафиолет в зависимости от длины волны и дозы может вызывать как летальный, так и мугагенный эффект.
При этом прежле всего повреждаются молекулы ДНК. В них возникают тнминовые димсры, ингнбируюшие репликацию. Поврежления могут быль устранены лвумя путями: фоторевктивацней н темновой репарацией. В первом случае поврежденное место репарируется ферментом, активируемым синим (вилнмым) светом, который исправляет структуру ДНК, расщепляя связи межлу тиминовыми основаниями в лимерах. Во втором случае свет не нужен, поврежлсния устраняются с помощью ферментов: эндонуклеазы (вырезает поврежденный участок), полимеразы (синтезирует правильную структуру ло комплемевтарной цепи) н лигазы (сшивает синтезированные последовательности). Ультрафиолет с Х = 325 — 400 нм также вреден для микроорганизмов, поскольку наряду с образованием тиминовых лимсров разрушается триптофан и образуются его токсичные фотопродукты, которые действуют как химические мутагсны.
Наибольший эффект УФЛ наблюдается при длине волны 2б0 нм, совпадающей с максимумом поглощения ДНК клеток. Выживаемость клеток эксцоненцначьно зависит от дозы УФЛ. Облучать клетки слелует в буферных растворах, так как вегцества питательного бульона интенсивно поглощают УФЛ, снижая тем самым дозу, пслучаемую клетками. В то же время образующиеся в бульоне под действием облучения токсичные пере- 404 кнсн увеличивают летальное действие УФЛ на клетки. Все манипуляции следует осуществлять в условиях, исключающих воздействие видимого света, чтобы процесс фошреактнвации не исказил результаты. Для характеристики мутагенного действия УФЛ часто используют обратные мутации.
Несмотря на то что часть реверснй обусловлена супрессорнымн мутациями, этот тест удобен, так как позволяет испольювать прямые методы отбора мутантов с помощью селектнвных сред н таким образом увеличить размер анализируемой популяции. Концентрацию н частоту обратных мущций по одному гену прн этом выражают в числе мугантов на определенное количество жизнеспособных клеток (например, 1. 10').
длЛЖвч:~ ~ кч юли уаЛ Е. сой и определение зависимости выживаемости клеток и частоты мутаций по каждому гену от дозы облучения. Ход выполнения задачи Микроорганизм. В работе используют штамм У;. со11 АВ ! 157 гпг, !ец-, агяЕ, ргоА, 11и, 1ас, яа1, аш, ху1, згг-г, Г'-з, нуждающийся в треонине, лейцине, аргинине, пролине и тиамине (В,), а также лактозо- и галактозоотрицательный, способный использовать арабинозу и ксилозу, стрептомицинустойчивый и температурочувствитсльный. Среды и растворы.
В качестве полноценной среды применяют мясопсптонный бульон (МПБ) с рН 7,0. Для приготовления твердой среды к МПБ добавляют 2% агара (МПА). Среду стерилизуют при 1,0 ати. После стерилизации вносят 2 % глюкозы в виде 40 %-го раствора, простерилизованного при 0,5 ати. В качестве минимальной применяют среду Гловера следующего состава (г/л): ХН4С! — 5,0; )чН,)чО, — 1,0; (чатб04 — 2,0; К,НРО4 — 3,0; КН,РО4 — 1,0; МяБО~ 7НтΠ— 0,1; рН 7,0. Для получения твердой среды добавляют 2 % агара. Среду стерилизуют при 1,0 ати. После стерилизации вносят 1,5 — 2 % птюкозы в виде 40%-го раствора, простернлизованного при 0,5 ати. Для выявления обратных мутаций по локусам гпг и 1ец используют селективные среды 1 АРВ, и ТАРВ, соответственно.
Сслективную среду 1.АРВ, получают добавлением лейцина, аргинина, пролина и тиамина в минимальную среду Гловера, а среду ТАРВ, — добавлением треоннна, аргипина, пролина и тиамина. Аминокислоты и витамин стерилизуют отдельно в виде концентрированных растворов при 0,5 ати н вносят в стерильные среды до конечных концентраций 100 мг/л и 10 мг/л соответствс1шо. Для отмывки и ресуспепдирования клеток, а также для приготовления десятичных разведегп1й суспензии готовят 50 мМ К-фосфатный буфер, рН 7,0.
Общая схема эксперимента приведена на рис. 35.3. Для получения исходной суспензия клеток Е. со!1 проводят посев культуры со скошенной агарнзованной полноценной среды в 50 мл МПБ в круглодонных колбах на 250 мл (1 полную петлю). Колбы помещают на круговую качалку и инкубируют 18 ч при 37'С и 200 об/мин.
Выросшую культуру (15 мл суспснзии клеток на 1 студента) стерильно центрифугируют 10 — 15 мин при б тыс. я, предварительно пометив уровень жидкости в попарно уравновешенных вместе с пробками цептрифужных стаканах. После осаждения клеток надое щочную жидкость сливают в емкость с дезраствором, а осадок перемешивают стерильной стеклянной палочкой до гомогенного состояния и заливают 50 мМ К-фосфатным 405 буфером (рН 7,0) до прежнего уровня и снова центрифугируют в том же режиме. Осажденные клетки ресуспендируют выгнеприведенным способом в буфере и содержимое обоих центрифужных стаканов сливают в стерильную пробирку. Полученная суспензия должна содержать примерно 2.10в клеток в мл.
Суспензию разливают по 3 мл в стерильные чашки Петри по числу вариантов опыта (контрольный вариант остается в пробирке). Все вариагпы опыта следует оберегать от попадания света. Суспензию бактерий облучают с помощью установки, состоящей из двух ламп БУФ-15, смонтированных параллельно на специальном стенде. Используются дозы в 1, 2, 3 и 4 тыс. эрг/ммт, которым на установке соответствуют экспозиции в 8, 1б, 24 и 32 с на расстоянии 5 см от ламп.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
