А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 121
Текст из файла (страница 121)
Результаты вносят в табл. 35.4, определяя летальные эффекты мутагена (при сравнении вариантов 1 и 2) и пенициллина (при сравнении вариантов 3 и 4). Для определения ауксотрофных колоний проверяют способность к росту на минимальной среде у 100 колоний из каждого варианта опьгга (рис. 35.5).
Для этого готовят восемь пар чашек: с полноценной (МПА) и минимальной (среда Гловера с тиамином и глюкозой) средами. Наружную сторону дна каждой чашки расчерчивают на 50 пронумерованных квадратов. Затем каждую из 100 колоний выссвают на две чашки (с минимальной и полноценной средой) в квадраты с одинаковыми номерами. Это удобно делать кончиками стерильных спичек или заостренными концами полосок плотной бумаги. Для переноса каждой колонии используют свою спичку или полоску — концом спички прикасаются к выбранной колонии, затем к поверхности агара в соответствующем квадрате чашки с минимальной средой, а затем к поверхности МПА в квадрате с таким же номером. Засеянные чашки инкубирукзт 24 ч при 37 С.
В парных чашках сравнивают рост колоний в квадратах с одинаковыми номерами (чашки е МПА ие аткрывать7). Колонии ауксотрофов распознают по отсутствию роста на минимальной среде. Результаты подсчета вносят в табл. 35.5. Ио и Для идентификации ауксотрофов отбирают 10 колоний (желательно из варианта 2) и каж- Е l Дг г аю лой из 12 чашек (рис.
35.6). Каждая чашка содержит минимальную среду ДДв Гловера с одной из комбинаций ростовых веществ. Комбинации ростовь|х веществ представ- ~ / ~1 лены в табл. 35.6. Колонии мутантов обычно малы, поэтому колонию, снятую с МПА, суспендируют в неболь- К Д5 шом количестве буфера, и для посева на каждой из 12 чашек с комбинациями делают злтрих Рис. 35.6.
Схема посева 10 зеркальцем петли, опущенной в зту суспензию, ауксотрофов иа чашку со Засеянные чашки инкубируют 24 — 43 ч при сРедой Гловераи одной из 37 С. комбинаций ростовых веществ дз 413 Таблица 35.6 Комбинация ростовых веществ д,,зя идентификации ауксотрофов Номер ком- бинации Биотин Лденин Фенилаланнн Лейцин Аргинин Лланин Гипок- санзнн Фолиевая кислота Серии Ц Ор питии Глицин Пантстеновая кислота Цито- зин Аспарагиновая кислота Триптофан Изолей- цин Треонин 10 Гуанин Пирилоксин Тирозин Тиосуль- фат натрия Пролин Гисти- дин Тимин Лара-Амино- бензойная кислота Глутаминовая кислота Тиамип Метнонин Лизин 12 Урания Рибофлавнн Инозит Никотнноьая кислота Холин Валин Материалы, оборудование, посуда, реактивы Центрифуга, счетчик колоний, микробиологическая петля.
Чашки Петри — 75: пробирки обычные с ватными пробками — 30; пробирки широкие — 2; стеклянные палочки — 2; стеклянные центрифужные стаканчики с пробками — 2; стеклянные шпателн — 5; пипетки на 1 мл — 30; на 0,1 мл — 5; на 5 мл — 5; спички без серных головок — 400. МПБ — 100 мл; МПА — 1 л; минилнльная среда Гловера с глюкозой н тиамином — 5 мл; агаризованная минимальная среда Гловера с глюкозой и тиамином— 200 мл; селектнвные среды с разными комбинациями ростовых веществ — по 30 мл; 50 мМ К-фосфагный буфер (рН 7,0) — 0,2 л; 50 мМ К-фосфатный буфер (рН 6„0) нли 50 мМ цитрнгный буфер (рН 5,5) — 10 мл; раствор мугагена — 1 мл; раствор пенншпшнна — 0,5 мл.
План проведения задачи Занятие 1. Приготовление и стерилизация сред, растворов и посуды (4 ч). Посев и инкубация бактериальной культуры (18 ч). Занятие 2. Обработка бактериальных клеток мутагеном. Приготовление десятичных разведений и посев на чашки с МПА. Посев обработанной мугагсном культуры в МПБ на полращивание (4 ч). Инкубация засеянных чашек и пробирок (24 ч).
Занятие 3. Посев обработанной мутагеном культуры после роста на МПБ на минимальную среду Гловера и инкубация для истощения эндогенных запасов питательных веществ (3 ч). Обработка клеток пенициллином (1 ч). Приготовление десятичных разве- 414 При просмотре результатов посева отмечают, на каких комбинациях веществ растет данный мутант. Специфические потребности выделенных мутантов определяют следующим образом: если мутант растет только на двух каких- либо комбинациях веществ, то он нуждается в соединении, которое входит в состав обеих комбинаций. Например, если мутант дает рост на среде с комбинациями )хе 3 и )хй 9, то он нуждается в триптофане.
Однако следует учитывать, что мутанты могут быть дефектны не по одному, а по нескольким мстаболитам (мутант будет расти на одной комбинации или более чем на двух комбинациях, или на нескольких комбинациях, не имеющих общих компонентов). дений культуры со среды Гловера и после пенициллинового обогащения и посев на чашки с МПА (1 ч). Инкубация засеянных чашек (24 ч). Занятие 4. Подсчет колоний на чашках МПА во всех вариантах опыта и определение летального действия мутагена и пенициллина (1 ч). Пересев колоний из каждого вариагпа опыта на пары чашек с полноценной и лгинимальной средами для выявления ауксотрофных мутантов (3 ч).
Инкубация засеянных чашек (24 ч). Зашпие 5. Определение содержания ауксотрофных мутантов в каждом варианте опьпа. Пересев мутантов на селективные среды с комбинациями росювых веществ (4 ч). Инкубация засеянных чашек (24 — 48 ч). Занятие б. Идентификация ауксотрофных мутантов и оформление результатов (4 ч). ЗАДАЧА 3. КОНЪЮГАЦИЯ У ЕЗСНЕг(IСН!А СОМ. КАРТИРОВАНИЕ ГЕНОМА ПО ГРАДИЕНТУ ПЕРЕДАЧИ МАРКЕРОВ Конъюгация предполагает непосредственный контакт клетки-донора и клетки-реципиента. Клетка-донор должна облалать плазмидой, или Г-фактором, который люжет быть автономен или интегрирован в хромосому. Г-фактор обусловливает способность донорной клетки вступать в контакт с реципиекгом, формировать половые Г-пили и передавать генетический материал.
При интеграции Г-фактора в хромосому такая передача осуществляется с высокой частотой (штаммы Н(г). Перенос генетического материала строго ориентирован: разрыв копии хромосомы и передача ДНК происходит, начиная с локуса оп в пределах полового фактора. Скорость переноса в одинаковых условиях для определенного штамма постоянна. Обычно всей хгхглгосоме не удается перейти в клетку-реципиент, так как контакт клеток очень нестабилен и часто прерывается до завершения перехода.
Реципиенту первым передается всегда один и тот же„ специфичный для каждого штамма, участок хромосомы, поэтому частота передачи стоящих следом за ним генов позволяет расположить их по отношению к этому локусу и составить генетическую каргу хромосомы. 1(гиьрабонгы: определить порядок расположения четырех локусов на хромосоме Е. соВ К-12 по градиенту их передачи рекомбинантам. Ход выполнения задачи Микроорганизмы.
В скрещивании испоггьзукггся щтаммы Вес)геггс(гга соВ К-12, различающиеся по резистентносги к стрептомицину и зависимости от ростовых факторов: в качестве донора — НГг Н Вп мг-з (тиаминзависимый, стрептомицинчувствительный), в качестве реципиента — 1-62 (Ы „Р, рго, !гу, Ыз, 1ас, згг-г (тиамин-, пролин-, триптофан- и гистидинзависимый, лактозоотрицательный, стрсптомицинусгойчивый). Среды и растворы. В качестве полноценной среды применяют МПБ и МПА, рН 7,0, а в качестве минимальной — среду Гловера (как в предыдущих задачах). Для отбора рекомбинантов применшот следующие агаразованные селекнгивные среды: ВВ, ТН+ глюкоза — среда со стрептомицином, тиамином, триптофаном, гистидином и ппокозой; ВВгРН+ глюкоза — среда со стрептомицином, тиамином, пролином, гистидином и глюкозои; ВВ, ТР+ а показа — среда со стрсптомиципом, тиамином, пролином, триптофаном и глюкозой; Я3г ТРН+ лактоза— среда со стрептомицином, тиамином, пролином, триптофаном, гиспщином 415 и лактозой.
Для приготовления селективных сред в минимальную среду Гловера вносят необходимые соединения в следующих количествах (мг/л): Ш,-аминокислоты — 100; Е-аминокислоты — 50; витамин — 10. Растворы этих веществ готовят на дистшшированной воде и стеригизуют при 0,5 ати или пропусканием через бактериальный фильтр. Лактозу вносят в той же концентрации и тем же способом, что и глюкозу.
Стрептомицин лобавляют из его концентрированного раствора в К-Фосфатном буфере до конечной концентрации 100 мг/мл. Для отмывки и ресуспендирования клеток, а также для приготовления лесятичных разведений суспензии готовят 50 мМ К-фосфатный буфер, рН 7,0. Культуры донорного и рсципиентного штаммов выращивают таким образом, чтобы к началу скрещивания иметь молодые клетки. Для этого петлей снимают одну колонию каждого штамма и помещают их в колбы объемом 250 мл с 50 мл МПБ. Колбы инкубируют в течение ночи (-18 ч) на качалке при 200 об/мин и 30 'С. Утром по 5 мл выросших культур засевают в такие же колбы со свежим МПБ и помешщот их на качалку при 37 'С на 3 ч.
Полученные таким образом суспензии штамма-донора и штамма-реципиента вводят в скрещивание в соответствии со схемой экслернмеюна (рис. 35.7). Проводят скрещивание двух штаммов Е. со(1 (НГг и 1-62), несущих разные генетические маркеры. В результате скрещивания возникают рекомбинанты, сочетающие признаки исходных родительских штаммов. Для проведения скрещивания 2 мл суспензии клеток 3-62 и 1 мл суспензии клеток НГг вносят в стерильную колбу на 50 ьш. Колбу помещают на термостатированную качалку, производящую мягкое покачивание (перемегпивание) суспензии ( — 30 об/мин). Скрешивание проходит 1,5 ч при 37 С. Во время скрещивания определяют максимально возможное количество конъюгативных пар, которое способно образоваться в данной смеси.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
