А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 124
Текст из файла (страница 124)
Далее студенты асептически добавляют в каждую из пробирок с расплавленным агаром по 0,1 мл суспензии клеток о. !урИвигшт ТА98, тщательно и быстро перемешивакп содержимое вращением пробирки в ладонях и немедленно асептически вносят в чашки с застывгпим подстилающим агаром под соответствуюшими номерами. Покачивая чашку с закрытой крышкой, добиваются равномерного распределения верхнего агарового слоя по поверхности нижнего подстилающего слоя и оставляют чашку на столе для затвердевания агара. Для контроля готовят на группу студентов 4 чашки с триптозным соевым агаром (ТС-агаром) в качестве подстилающего слоя и разливают сверху содержимое из 4 пробирок (культура о.
фрЬллигшт ТА98 и внесенные тестируемые вещества). Этот опыт продемонстрирует студентам необходимость использования минимального асара Эймса в качесгве подстилающего слоя в чашках Петри. 422 Таблица 35.8 Чашки инкубируют, не переворачивая, при 30 С в течение 48 — 72 ч. После окончания инкубации выбирают чашки с максимальным числом больших колоний и подсчитывают их.
Если число колоний на чашке слишком велико (более 300 на чашку), то делят поверхность на 2 или 4 равные части и просчитывают число обратных мутантов по секгорам, умножая затем на число секторов чашки. Колонии просчитывают на чашках с минимальным агаром и ТС- агаром.
Результаты подсчетов заносят в таблицу (табл. 35.8). После подсчетов чашки с добавленными мутагенами необходимо сложить в специальный лоток и подвергнуть обработке для дезактивации мутагенов (по инструкциям преподавателя). Интерпретация резульгатов эксперимента. Эймс-мугант Х брйтилигл не способен синтезировать гистидин. Па основной синтетической среде без гистидина (подстилающий слой) клетки мутанта нс растут, однако верхний слой полужидкого агара содержит минимальную концентрацию этой аминокислоты, достаточную для роста клеток в течение 2 — 3 генераций.
После инкубации мутанты дадут сплошной рост в верхнем, полужидком слое агара, что будет проявляться в виде небольшого равномерного помутнения среды, на фоне кгггорого отчетливо видны крупные колонии ревертантов к дикому типу. Сильные мутагены стимулируют возвращение Эймс-мутантов к их прототрофному состоянию (реверсии к родительскому фенотипу), которые уже не требует экзогенно добавленного гистидина лля формирования крупных колоний. Поэтому появление каждой крупной колонии на фоне газона остаточного роста в чашках свидетельствует о возникновении обратной мутации под воздействием мутагена или произошедшей спонтанно. Число колоний на чашке с добавленной в виде контроля дистиллированной водой вместо испытываемого мутагена определяет уровень спонтанного мугагснеза культуры в данных условиях.
Если тестируемое соединение дает уровень мугагенеза превышающий спонтанный мутагенез в два раза, то оно считается мутагеном и поэтому потенциальным канцерогеном для человека. Глава 36 ИССЛЕДОВАНИЯ БАКТЕРИОФАГОВ Бактерцальные вирусы (бактериофаги) представляют относительно простую биологическую систему и являются удобной моделью для изучения основных проблем молекулярной биологии и генетики. 423 Значительные успехи в изучении механизмов репликации нуклеиновых кислот, исследований тонкой структуры генетического матерщала, молекулярноьо механизма мутаций, регуляции белкового синтеза и многие другие достижения современной биологии связаны с применением бактериофагов как удобных модельных объектов. Бактериофаги заражают и реплицируются в самых различных бактериях, однако наиболее изучены бактериофаги кишечной палочки (Юсйепс/иа сой).
В связи с этим серия последующих задач посвящена освоению методов работы с бактериофагами этой группы. зАдАчА 1. выРАщивАниБ и хРАнвниБ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КУЛЬТУР Питательные среды. Выращивание клеток Е. сой можно проводить как на синтетической среде, так и на питателыюм бульоне. Питательная синтетическая среда, состоящая из 1ЧН«С1, МВБ04, КН«Р04, ХаНРО«и глюкозы, способна поддерживать рост кишечной палочки, одновременно обеспечивая буферные свойства раствора (реакция среды сохраняется на уровне, близком к нейтратьному).
Для ускорения процесса роста клетки Е. сой культивируют не на этой простой среде, а на питательном бульоне, содержащем а своем составе аминокислоты, азотистые основания и сахара. Следует отметитьь что клетки Е со11 принадлежат к классу так называемых Факультативных анаэробов, которые при наличии необходимых питательных веществ размножаются и в отсутствие кислорода. Поскольку размножение Е. сод в аэробных условиях протекает значительно быстрее, через питательную среду пропускают ток воздуха либо интенсивно встряхивают ее на качалке в целях аэрации. Выращивание бактерий можно проводить и на твердых питательных средах, получаемых добавлением к питательному бульону 1,5% агара.
Хранение бактериальиых культур. Бактериальные штаммы поддерживают путем пересева клеток с помощью металлической петли на «скошепный» питательный агар (1,5 %). Для получения чистой бактериальной культуры выращивают отдельные колонии этих клеток, рассеивая бактерии штрихами на чашках с питательным агаром. Выращивание бактерий. Бвктериальные клетки в процессе размножения в жидкой питательной среде проходят несколько фаз: лаг-период, логарифмическую фазу (период активного деления) и стационарную фазу. Деление клеток прекращается нз-за истощения запасов питательных веществ и выделения в среду токсических продуктов жизнедеятельности клеток. Хорошо аэрируемые кулйтуры Е.
со11, растущие в простой синтетической 'среде или на питательном бульоне, вступанп в стационарную фазу, когда концентрация бактерий достигает (2 — 5).10а клеток на 1 мл. Эффективное воспроизводство фагового потомства имеет место в период наиболее активного деления бактериальных клеток, т.е. в логарифмической фазе роста. Бактериальные культуры в логарифмической фазе можно условно разделить на две категории: собглмеьао логарифмические культуры, соответствующие середине логарифмической Фазы, и так называемые «ночные кулылуры», где бактерии находятся в самом конце логарифмической фазы. Для получения «ночной культуры» в пробирку с 5 мл пигательного бульона вносят посевной материал из отдельной колонии.
Пробирку инкубируют при 37 С в течение ночи без аэрации. К этому врел1ени концентрация клеток достигает 1.10«в 1 мл. Для получения культуры в логарифмической фазе роста «ночную культуру» разводят в 10 — 100 раз питательным бульоном и инкубируют при 37'С, 424 встряхивая на качалке для лучшей аэрации. Ипкубацию продолжают до тех пор, пока плотность культуры не достигнет (2 — 3) 10' клеток в 1 мл.
При разведении в 1О раз для подрвщивания клеток до указанной концентрации требуется 1,5 ч, а при разведении в !00 раз — 2,5 ч. Определение концентрации бактерий. Распространенный способ определения концентрации бактерий — метод подсчета бактериальных колоний на чашках Петри. Пробы (0,5 мл) соответствующих разведений бактериальной суспензии распределяют стеклянным шпателем по поверхности питательного агара и после пнкубации подсчитьгвают число колоний. Поскольку каждая бактериальная клетка дает начало отдельной колонии клеток, число колоний на чашке (с учетом разведения и объема наносимой суспензии) будет характеризовать исходную концентрацию бактерий в культуре. Например, если при нанесении на чашку 0,1 мл культуры, разведенной в 100 000 раз, образуется 100 колоний, то количество бактериальных клеток в 1 мл исследуемой суспензии составляет 100 10 10», т.е.
1 10'. В качестве эхслресечяетода определения концентрации бактерий в питательной среде чожно рекомендовать измерение нуеиссгли суслеиэии. Для этого необходимо иметь калибровочную кривую зависимости мутности от количества клеток в конкретных условиях выращивания, и естественно, что при изменении условий требуется построение вовой кривой. эы««««и» «« ~ г»г ««( ~ц ~ »- ванна) построить кривую роста клеток во времени лля условий, обычно используемых прн выращивании бактернофагов. Ход выполнения задачи Чашки Петри с питательным агаром для посева бактерий готовят в день опьпа или накануне. Расплавленный агар разливают в чашки по 20 — 30 мл, что соответствует '/, объема чашки.
После застывания агара чашки выдерживают зля просушивания в термостате прн 37 'С в течение ночи в перевернутом положении с закрытыми крышками. Избыток конденсацнонной воды можно удалить, выдерживая чашки в перевернутом положении с открытыми крышками в термостате в течение 1 ч. При необходимости чашки с агаром можно хранить в холодильнике в течение нескольких дней. Для получения «ночной культуры» Е.
со!1 в стерильную пробирку с питательным бульоном (5 мл) вносят петлей посевной материал из отдельной колонии на чашке. Смесь ннкубируют в течение ночи без аэрации. В стерильный флакон на 250 мл вносят 30 мл питательного бульона и 3 мл ночной бульонной культуры Е. сой. Инкубационную смесь ставят на качалку при 37 С и азрируют в течение 2 ч, Через 60, 90 и 120 мин стерильно отбирают по 3 мл суспепзии. В каждой пробе определяют мутность и количество бактериальных клеток. О мутности судят, определяя интенсивность светорассеивания оактериальной суспензин прн длине волн 600 нм. Перед высевом проб из чашки Петри суспензию клеток разводят серией десятикратных разведений в стерильном физиологическом растворе.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
