А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 120
Текст из файла (страница 120)
Облучение бактерий проводят в открытых чашках Петри (диаметр 100 — 110 мм). Для каждой дозы Посев со скошенного МПА (одна полная петля) Рнс. 35.3. Схема опыта по определению действия ультрафиолета на клетки Есо1т используют отдельную чашку с 3 мл суспснзии (вариант опыта). Во время облучения чашку постоянно покачивают для перемсшивагптя суспепзии. Время контролируют по секундомеру. После облучения чашки закрывают крышками и помещают в темное место. Для определения количества жизнеспособных клеток из облучепных и контрольной суспензий берут по 0,5 мл и делают ряд десятичных разведений в 50 мМ К-фосфатном буфере, рН 7,0.
Конечное разведение каждого варианта опыта зависит от дозы облучения: Из пяти последних разведений каждого варианта отбирают микропипеткой по 0,1 мл„вносят на поверхность двух чашек Петри с МПА и 'пцательно растирают стеклянными шпателями. Чашки помещают крышками вниз в термостат (37 'С) на 24 ч (возможно выращивание при 30 С, но более длительное время).
Для определения концентрации обратных мутантов по 0,1 мл суспензии каждого варианта высевают без разведения на селективные среды (5 чашек со средой 1 АРВ, и 5 чашек со средой ТАРВ~). Засеянные чашки с селективными средами помещают крышками вниз в термостат (37 С) на 48 ч. По истечении времени шгкубации подсчитывают число колоний на чашках.
При подсчете колоний на МПА выбирают чашки, где выросло не более 100 колоний (нанболее удачное разведение суспензии), рассчитывают количество жизнеспособных клеток в 1 мл суспензии каждого варианта и выражают выживаемость облученных УФД клеток в процентах от контроля. Даннгяе вносят в табл. 35.2. Вычерчивают кривые выживаемости в арифметической и логарифмической шкалах в зависимости от дозы облучения. Подсчет колоний на селективных средах (число жизнеспособных клеток в этих вариантах уже известен: см. 4-й столбец табл. 35.2) позволяет определить Табл и ца 35.2 Летальное действие УФЛ иа клетки Е.
сей Ай 1157 407 Таблица 35.3 Мутагенное действие УФЛ на клетки Лл сод АВ 1157 " Данные берутся нз табл. 35.2, концентрацию обратных мутаций по локусам (пг и !ец в разных вариантах опыта. Данные вносят в табл. 35.3. Для каждого локуса строят кривую зависимости частоты мутаций от дозы облучения.
После обработки каждым студентом собственных результатов опрсделяется средняя по всей группе выживаемость н мутабильность по двум локусам для каждой дозы УФЛ. Результаты каждого студента принимаются за повторность опыта всей группы. Материалы, оборудование, посуда, реактивы Центрифуга; источник УФЛ; секундомер; тсрмостат на 37 С; счетчик колоний; микробиологическая петля. Чашки Петри — 110; пробирки с ватными пробками — 35; стеклянные палочки — 2; стеклянные центрифужные стаканчики с пробками — 2; стеклянные шпатели — 35; пипетки на 1 мл — 30; на 0,1 мл — 30; на 5 мл — 5; на 1О мл — 3.
МПБ — 50 мл; МПА — 1 л; селективные среды — по 0,5 л; 50 м М К-фосфатный буфер (рН 7,0) — 0,2 л. План проведения задачи Занятие 1. Полготовка и стерилизация посуды н сред (4 ч). Посев бактерий в МПБ и их вырашивание (18 ч). Занятие 2. Приготовление суспензии клеток бактерий..Облучение, приготовление разведений и посев бактерий на МПА и селекгивные среды (4 ч). Инкубация посевов (24 и 48 ч). Занятие 3. Подсчет колоний, выросших на МПА и селективных средах.
Оформление результатов (4 ч). ЗАДАЧА 2. ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ АУКСОТРОФНЫХ МУТАНТОВ ЕВСНЕВ!СН!А СО(1 Термин «биохимические мутантыэ обычно используют для обозначения мутантов с измененными метаболическими процессами. Среди биохимических мутантов наиболее изучены ауксотрофные мутанты, которые угратили способность к синтезу необходимых для их роста соединений (аминокис- лот, витаминов, азотистых оснований и т.д.) в отличие от прототрофных микрооршнизмов, способных к такому синтезу. Для развития ауксотрофного организма в питательную среду необходимо добавлять дополнительные факторы роста. Частота спонтанного возникновения мутаций любого типа обычно не превышает 1О '.
Для ее повышения применяют различные мугагенные факторы, наиболее эффективные из них нитрозосоецинения. При обработке популяции клеток такими химическими мутагенами удается получить ло 1Π— 20 % биохимических мутантов. Мугагенный эффект химических соединений, как правило, связан с возникновением точечных мугаций, в то время как физические мутагены вызывают в большей степени аберрации и поломки хромосом. При использовании химических мутагенов большое значение имеют условия обработки, концентрация вещества, продолжительность экспозиции, рН среды и др. При проведении эксперимента необходимо учитывать задержку в проявлении мутантных микроорганизмов, которая связана с сегрегационным и фенотипическим лат-периолами.
Вылеление мушнтов определенного фенотипа или мутантов по одному гену из популяции прототрофов ловсльно трулоемко, так как нх соцержание даже после обработки химическим мутагеном очень мало. В этих случаях применяют специальные методы обогащения лля повышения относительного количества ауксотрофных мутантов в популяции прототрофов. Лййб ~ й «д ф й ~ 1 ~м ~ е ы под действием ннтрозосоелнненнй с послелующсй обработкой пенициллином. Ход выполнения задачи Микроорганизм. В работе используют один из штаммов Е. соб К.-!2 11п- (Н(г 5, 109 нли 85). Среды и растворы. В качестве полноценной среды применяют МПБ и МПА, рН 7,0; в качестве минимальной применяют среду Гловера (как в предыдущей задаче). Для приготовления селсктнвных сред в минимальную среду Глоеера вносят необходимые соединения в следующих количествах (мг/л): 1Н.-аминокислоты— 100, 1-амннокнслотчя — 50„витамины — ! О, азотистые основания н нуклеознлы — 20.
Растворы этих веществ п>топят на дистиллированной воде н стернлнзуют при 0,5 атн нлн пропусканием через бактериальный фильтр. Для приготовления десятичных разведений суспензия перел посевами и раствора пеннциллгпга готовят 50 мМ К-фосфатный буфер, рН 7,0. Прн использовании в качестве химического мутагена ннтрозоэтплмочевины (НЭМ) лля ресуспенлирования клеток и приготовления раствора мутагена готовят 50 мМ К-фосфатный буфер, рН 6,0 (Точное значение! Проверять по рН-метрут). Если для индуцированного мутагенсза применяют нитрозогуанидин (НГ), то готовят 50 мМ цитратный буфер, рН 5,5 (Точное значение! Проверять но рН- метру1).
Общая схема эксперимента приведена па рис. 35.4. Культуру Е, соЫ выращивают на МПБ в колбах на качалке (200 об/мин) в течение !8 ч при 37 С. Плопюсть культуры лолжна сгютветствовать 2 10э клеток/мл. Выросшую культуру, взятую в количестве 2 мл, стерильно центрифугируют при 6 тыс. я в течение 15 мнн, бульон сливают в лсзраствор, осадок тщательно растирают стерильной стеклянной палочкой н ресуспендируют в исход- х ~~ цц а~ о ~ Д 3,~ ооо о ~В Ю, о ио о® '„и 'аЯ Д Таблица 35.4 Табл и ц а 35.5 Определение летального аффекта нптрозоэтплмочепнны (нлп ннтрозогуанндпна) и пенициллина Определение количества ауксотрофных лгутлнтоп в разных вариантах опыта (количество отесанных колоний равно 100) 412 ном объеме буфера.
При работе с НЭМ в качестве мугагена используют 50 мМ К-фосфатный буфер, рН 6,0, а для НГ применяют 50 мМ цитратный буфер, рН 5,5. Полученную суспензию делят на две порции: 1 мл смешивают с 1 мл раствора мутагена (2%-го раствора НЭМ в 50 мМ К-фосфатном буфере, рН 6,0 или 0,02%-го раствора НГ в 50 мМ цитратном буфере, рН 5,5), а оставшийся 1 мл суспензии — с 1 мл соответствующего буфера без мутагсна (когпроль).
Обе порции инкубируют на качалке 30 мин при 37'С. Затем делают десятичные разведения смесей в 50 мМ К-фосфатном буфере, но уже рН 7,0. Начинать слсдует с варианта, обработанного мутагеном, что позволяет остановить его действие. Вариант с мутагеном разводят до 10 ~ и производят выссвы из исходной суспензии и из всех разведений по 0,1 мл на чашки с МПА в двух повторностях. Эту серию посевов обозначают как вариант 2. Контрольный вариант разводят до 10 ~ и высевают по 0,1 мл из четырех последних разведений на чашки с МПА в двух повторностях. Эту серию посевов обозначают как вариант 1. Вес засеянные чашки с МПА инкубируют 24 ч при 37 С (или 48 ч при 30 С), а затем хранят в холодильнике до использования. Из второго разведения 0,05 мл обработанной мугагеном суспензии переносят в пробирку с 5 мл МПБ для подращивания и помещают на качалку на 24 ч при 37 С.
Затем 0,05 мл выросшей культуры переносят в 5 мл теплой среды Гловера с тиамином и глюкозой и выдерживают на качалке 3 ч при 37 С для истощения эндогенных запасов питательных веществ в клетках. После инкубации из пробирки отбирают 0,5 мл культуры для приготовления десятичных разведений до 10 ь в К-фосфатном буфере, рН 7,0. Из четырех последних разведений высевают по 0,1 мл на чашки с МПА в двух повторностях и инкубируют 24 ч при 37'С (или 48 ч при 30'С), а затем хранят в холодильнике до использования. Эту серию посевов обозначают как вариант 3. К оставшимся в пробирке со средой Гловера 4,5 мл суспензии приливают 0,5 мл раствора пенициллина в том же буфере, так чтобы конечная концентрация антибиотика составила 2000 ед./мл. Смесь оставляют на качалке при 37 'С на 1 ч, а затем готовят разведения до 10 з и высевазот из них по 0,1 мл на чашки с МПА в двух повторностях.
Все засеянные чашки с МПА инкубируют 24 ч при 37 'С (или 48 ч при 30 'С), а затем хранят в холодильнике до использования. Эту серию гюсевов обозначают как вариалгп 4. Рвс, 35.5. Схема рассева колоний нз каждого варианта для определения ауксотрофов В каждой серии посевов отбирают чашки из наиболее удачных разведений и делают подсчет колоний для определения числа жизнеспособных клеток в 1 мл суспензии каждого варианта. Подсчет ведут, не раскрывая чашек, поскольку в дальнейшем из них проводится отсев колоний.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
