А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 123
Текст из файла (страница 123)
Полная программа теста Эймса описана в специальном руководстве (лз. Бег)1вгг(, 1994). Многие химические соединения пе являются мутагенными (или канцерогенными) до тех пор, пока не будут подвергнуты действию микросомальных фсрментных комплексов, находящихся в печени животных. Химические превращения веществ в канцерогенную форму нередко являются частью нормального процесса, происходящего в печени в связи с индукцией ферментов, ответственных зв детоксикацию вредных соединений, которые могут быль опасными для организма.
Некоторые химические вещества илп их производные реагируют с детоксифицируюшимп ферменпьми (оксигеназами) с образованием эпоксидов, связывающихся с ДНК клетки. Таким образом, организм может превратить относительно невредное соединение в потенциальный мутагеп (канцероген). По этой причине в тесте Эймса перед добавлением химических веществ к мугантвм Эйлюа все проверяемые вещества обрабатывают индуцированными препаратами печени крыс. Дпя образования детоксифицирующих ферментов в печени крыс животным делают инъекцию препарата Агос!ог, имеющегося в пролвже.
Затем крыс забивают, печень удаляют и гомогецезируют, а гомогецаты используют в тесте Эймса. В звлаче студенты испытывают класс химических соединений, известных как лигврокинцервгены. Эти вещества относительно безвредны сами по себе, однако в гастроэнтервльном тракте животных онп под действием ферментов и фсрментпых систем энтеробактерпй превращаются в нитрозамины — потенциальные капцерогены (мутагены). Поскольку мутанты Эймса (Х ~ур1хтигГит) также принадлежат к эптеробактериям, а в зэлаче исследуются только нитроканцерогены, то в данном случае можно исключить стадию обработки испытываемых соединений фермептными препаратами печени крыс.
Общая схема проведения теста Эймса. Каждый тестируемый препарат обрабатывают гомогепатом печени животного (обычно крысы). Аликвоты суспензий каждого мутанта Эймса распределяют по чашкам Петри с плотной агаризованной средой со следами гпстидина. Затем в центр чашки помещают диски стерильной фильтроввльной бумаги, смоченной лпстиллировапной водой (контроль) или растворами рвзли шых концентраций тестируемого соединения после его контакта с «активируюшей» смесью ферментов из печени. Проверяемое соединение диффуцдирует в среду, формируя градиент концентрации. Если тестируемое вещество являешься мутагеном или превра»лается в 420 него под действием ферментов печени, то некоторые мутантные клетки, реагируя на него, будут образовывать колонии. Чем сильнее мутагепный эффект тест-соединения, тем больше колоний образуется на чашке вблизи диска, и тем дальше от диска они будут встречаться.
Слабые мутагены вызывают образование меньшего числа колоний ревертантов, и опи появляются ближе к диску. Друпзми словами, частота реверсий зависит аг потенциальной мутагенной способности и концентрации того или иного соединения. Чашки с дисками, смоченными в дистиллированной воде, дают очень небольшое число спонтанных обратных мутаций; они служат отрицательным контролем эксперимента. Недостатком тестирования с помощью градиентной концентрации является то, что количества действующего вещества достаточно трудно определить. Ьолее точные результаты по количественным характеристикам силы мугагена можно получить другим способом.
В чашки Петри поверх застывшей агаризованной среды (минимальный агар Эймса) заливают еще один слой полужидкой среды с минимальной концентрацией гистидина, куда вносят определенную аликвоту клеток (в мл) и известную концентрацию испытываемого соединения. Тест Эймса был применен для испытаний тысяч химических веществ, таких, как промышленные химикаты, косметические препараты, краски для волос, пищевые добавки и пестициды.
В каждой категории этих вегцесгв были обнаружены потенциальные канцерогены. Высокая частота реверсий не всегда свидетельствует о канперогенности проверяемого соединения. Точные доказательства мо1ут быть получены только в опытах на животных. В то же время только несколько из более чем 300 известных канцерогенов животных не вызывали повышенной частоты реверсии в тесте Эймса. Техника безопасности прн работе с мутагенамн (потенцнальнымн канцерогенамн).
° Исходные (концентрированные) растворы мутагена студентам не выдаются, аликвоты этих растворов в расплавленный и остуженный агар вносит преподаватель или лаборант. Исходный раствор мутагена не должен быть доступен для студентов. ° Всю работу проводят в резиновых перчатках для исключения попадания мутагена на кожу. Вся лабораторная посула, находившаяся в контакте с мугагеном, должна быть сложена в специальную емкость для последующей обработки и дезактивации.
Чашки Петри, в которые вносили ьплнген, после эксперимента должны быть также дезактивированы лаборантом. Перед началом практической работы студенты должны изучить технику безопасности по работе с мутагенами, после чего расписаться в специальном журнале. Ход выпопнения задачи Для выращивания мутантов Эймса готовят: 1) минимальный агар Эймса для использования в качестве подстилающей среды в чашках Петри при проведении тестирования химических соединений на мутнгенность (вреда !); 2) лолу- жидкий агар верхнего слоя Эймса в чашках Петри с минимальной концентрацией гистидина (среда 2).
Состав среды 1 (количество компонентов на 1 л): глюкоза (40 ого-й раствор)— 50,0 мл; раствор солей Уойе!-Воппег — 20 мл; агар — 15,0 г. Раствор солей Уойе1-Воппег (г7л): МВБОл.7НзΠ— 10,0; лимонная кислота (моногидрат)— 100,0 г; КгНРОл (б/в) — 500,0'„)ЧаН)ЧН4РО~ 4НгΠ— 175,0. Для приготовления раствора необходимо подогреть около 1,5 л дистиллированной воды до 45 С. Растворить компоненты раствора в указанном порядке один за другим в 600 мл подогретой дистиллированной воды, довести до 1 л, разлить по сосудам с навинчивающимися пробками и простерилизовать при 421 1 ати с полуоткрытыми пробками для уравнивания образующегося внутри сосудов давления. После автоклавирования и охлаждения раствора завернуть крышки плотно.
Хранить раствор при комнаттюй температуре. Для приготовления атаровой среды простсрилизовать 1,5 %-й агар на дистиллированной воде при 1 ати, затем расплавить его и инкубировать при 50 'С на водяной бане. К 930 мл расплавленной агаризованной среды прилить 50 мл нагретого до той же температуры раствора стерильной 40 %-й глюкозы (стерилизация автоклавированием при 0,5 ати) и 20 мл нагрегого раствора Чо8с)- Воппег. Среду хорошо перемешать и разлить при температуре 50 С по стерильным чашкам Петри по 30 мл в каждую. Среду 2 получают смешением нагретых до температуры 50 'С агаровой смеси (100 мл) и 10 мл раствора биотина с гистидином.
Агаровую смесь готовят растворением 5 г !4аС! в 500 мл дистиллированной воды, доведением обьема до 1 л, расплавлением в нем 6 г агара и автоклавированием по 100 мл в колбах на 250 мл при 1 ати. Раствор биотина с гистидином готовят растворением 1,24 г Ю-биотина и 9,6 г Х-гистидина в 10 мл дистиллированной воды, сгерилизуют при 0,5 ати и хранят при 4 С в холодильнике. Агаровая смесь (г/л): агар — 6,0; Ь!аС! — 5,0. Раствор биотина и гистидина (мг/л): биотин — 124,0; гистидин— 96,0. Перед началом экспериментом в смесь анаровой среды (0,6 %) с раствором биотин-гистидина добавляют суспензию тест-организма, стерильную дистиллированную воду (контроль) или растворы испытываемого вещества и разливают по чашкам с застывшим подстилаюшим слоем агара (1,5 %).
Преподаватель добавляет в расплавленный полужидкий агар стерильную дистиллированную воду (контроль) и стерильные растворы мугагенов в разных концентрациях. Содержимое пробирок тщательно перемешивают. Пробирки до внесения их на чашки с твердым агаром следует держать при 50 С на водяной бане. Каждый студент заливает 4 чашки Петри расплавленной в пробирках подстилающей средой Эймса и каждую чашку аккуратно подписывает: имя, дата, контроль, опыт 1, 2 или 3 (разные химические соединения соответственно). Для эксперимента каждый студент имеет четыре пробирки с полужидким расплавленным агаром, помеченные контролем (дистиллированная вода) или опытами 1, 2 или 3, Преподаватель сообщает студентам названия испытываемых соединений, которые они записывают в лабораторную тетрадь.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
