А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 122
Текст из файла (страница 122)
Оно равно числу жизнеспособных клеток штамма-донора 111Гг), поскольку клетки штамма-реципиента берутся заведомо в избытке. Для определения количества жизнеспособных клеток штамма НГг готовят дссятичньге разведения в 50 мМ К-Фосфатном буфере и высевают по 0,1 мл суспензии из разведений 10 4 — 1О ' на чашки Петри с МПА. Засеянные чашки инкубируют 24 — 48 ч при 30 'С. Чтобы убедиться в неспособности обоих штаммов ГНГг и 3-62) расти на используемых селективных средах„исхолные суспензия ролительских штаммов центрифугируют и ресуспендируют в К-фосфатном буфере до получения разбавленных суспензий.
Затем на разные селективные среды петлей наносят прямые штрихи из суспензий, используя для каждого штамма свою половину чашки. По окончании скрещивания с помощью селективных сред производят отбор рекомбинантов по каждому из четырех анализируемых генетических маркеров и определяют частоту образования рекомбинантов в процентах от числа живых клеток донорного штамма. Для этого готовят десятичные разведения конъюгационной смеси до 1О 5. На каждую селективную среду в двух повторностях выссвщот по 0,1 мл из разведений РО а — 10 -'. Засеянные чашки инкубируют при 37 'С в течение 24 — 48 ч. Подсчитывают число колоний штамма-донора на МПЛ и количество колоний рекомбинантов на селективных средах. Определяют концентрацию клеток Н1г и рекомбинантов рго'згг-г, пу'зГг-г, )йз'згг-г, 1ас'згг-г в конъюгационной смеси.
Частоту образования рекомбинантов вгяражают в процентах от числа клеток пггамма-донора, введенных в скрешивание. Результаты вносят в табл. 35.7. 416 Суспензия Н(г (донор) Суспензия У-б2 (реципнент) 15 мл в3 пензии шмма- 3 мл Посев по 0,1 развецений 1 1О на МПА двух повтори щиванне 1,5 ч алке 30 об/мин и37 С Инкубация при 30 'С 24 — 48 ч Центрифугирование 15 мин прн б тыс.л и ресуспендирование в буфере (разбавленная суспензия) Инкубация при 37 'С 24 — 43 ч Рис. 35.7. Схема опыта по конъюгацнн На основании полученных данных определяют послеловательность анализируемых маркеров на хромосоме Е. со)1 К-12. Представляют схему расположения этих маркеров по отношению к начальной точке оп'.
11гатериалы, оборудование, посуда, реактивы Центрифуга.„счетчик колоний; микробиологическая петля. Чашки Петри — 50 штб пробирки обычные с ватными пробками — 15; стеклянные палочки — 3; стеклянныс центрифужные стаканчики с пробками — 4; стеклянные шпатели — 1О; пипетки на 1 мл — 20; на 0,1 мл — 5; на 5 мл — 5; па 10 мл — 2; колбы на 2Я) мл — 4; на 50 зш — 1. 417 !4 нггргсав 0,5 мл для !григотовления десятичных разведений в буфере до 10 г Посев петлей штрихом на кажаую селективн1чо срелу 1 мл суспензия штамма- донора 11 все ные вух сгях Центрифугирование б тыс.я15мин и ресусггенаирование мл теплого МПБ Дентрифутирование 15 мин при 6 тыс. я и ресуспенднрование в буфере (разбавленная суспензия) Посев пеп!ей штрихом на кажаую селективную среду Таблица 35.7 Анализ копъюгацпоппого скрещивания Е.
еой К-12 Н(г х 5-62 по градиенту передачи маркеров донора рекомбпнаптам Количоспв колоний рекомбииаитов иа чашках Концентрация клеток в коньююциоииой смеси Отбираемых рекол1биРазиодеиис суспензия ияитм Содержание рекомбииаитов, % Солоктивиая среда ЯВ,ТН + глюкоза БВ,РН + глюкоза ЯВ,ТР + глюкоза БВ,ТРН + лактоза МПА Штамм Нй 100 МПБ — 250 мл; МПА — 200 мл; еелекгивные среды — по 200 мл; 50 мМ К-фосфатный буфер (РН 7,0) — 100 мл.
План выполнения задачи Занятие 1. Приготовление и стерилизация сред, растворов и посулы (4 ч). Подготовка бактериальных культур, вводимых в скрещивацие (22 ч). Занятие 2. Проведение скрещивания, приготовление разведений и посевы на селективные среды и МПА (4 ч). Инкубацня засеянных чашек (24 — 48 ч). Занятие 3. Подсчет колоний на чашках и обюрмлеыие результатов (4 ч). ЗАДАЧА 4. ИЗУЧЕНИЕ ИНДУЦИРОВАННОГО ХИМИЧЕСКОГО МУТАГЕНЕЗА С ПРИМЕНЕНИЕМ ТЕСТА ЭЙМСА 418 Известно, что определенные виды рака человека и животных вызываются химическими веществами, называемыми канцерогеналхн.
Поэтому важно иметь быстрый и дешевый способ определения потенциальной опасности большего количества химических соединений, имеющих контакт с пищей, входящих в состав новых продуктов, или веществ, попадающих в окружающую среду в результате хозяйственной деятельности человека. Проверка каждого химического соединения на его канцерогенность (способность вызывать раковые заболевания) с лабораторными животными занимает около 2 — 3 лет, и стоимость проверки одного вещества доходит до 100 000 дши.
США. Учитывая тысячи соединений, которые необходимо проверить, н стоимость каждого теста, можно убедиться„что проверки на животных слишком долговременны и дороги для массовых испытаний многих веществ. Поскольку 90 % от уже проверенных канцерогснов являются также л~угнагенпми, вызывающими хромосомные музации (это предполагает возникновение некоторых видов рака животных при соответствующих мутационных изменениях клеточных ДНК), Брюс Эймс с коллсшми из Калифорнийского университета (СШЛ) разработали тест, в котором использованы специальные мутантные шгаммы бактерий, чрезвычайно чувствительные к мутагенам.
С разработкой этого метода появилась возможность проверять множество химических соединений на мутагенность и потенциальную канцерогенность быстро и относительно недорого. Соединения„оказавшиеся сильными мутагенамн, в дальнейшем уже на животных проверяют на канцерогенность. Тест Эймса занимает несколько дней, и проверка одного соединения стоит лишь несколько сотен долларов. Природа мутагеиов Эймса Дикий тип энтеробактерий Яайиааейа ~урЫтипит, будучи прототрофом, растет на средах без добавок аминокислот и других факторов роста. Мутанты Эймса требуют наличия в питательных средах гистидина, поскольку они ауксотрофны по этой аминокислоте.
Мутанты получены путем одиночной вставки или делеции основания в последовательность генов, кодирующих синтез одного из ферментов пути биосннтеза гистидина. В результате такой мутации происходит сдвиг рамки считывания нуклеотидов и возникают «нонсенс-мутанты» по одному из генов, которые, однако, легко могут быть превращены в прототрофные штаммь| вставкой или делецией одного нуклеогида в нарушенную последовательность.
Такие мутанты, не способные расти на средах, в которые не добавлен гистцдин, называют гостидиизависим»о«и, или ауж-г«утаитаии. Кроме того по мутанты Эймса являются делеционньгми, они также лишены репарационных систем, которые обычно исправляют такого рода делеционные мутации. Возвращение к прототрофному состоянию для такого рода мутантов без систем репарации ДНК невозможно без дополнительных мутаций, поэтому такие штаммы довольно стабильны, т.е. дают небольшой процент спонтанных ревертантов, что важно зля проведения теста. Все, что нужно клетке аул--мутанта для возвращения в прототрофное состояние, — вставить выпавший нуклеотид в место делеции, а это может произойти только в результате инсерционного мутагенеза, когда клетка будет способна снова синтезировать гистидин и станет прототрофной по этому соединению (реверсия, обрвгная мутация).
Поскольку мутагены увеличивают частоту (скорость) мутаций, возникающих в популяпии клеток без видимых причин (спонтанных мутаций), они будут также увеличивать частоту обратных мугаций (реверсий) мутантов Эймса. Чем сильнее действует на ДНК мутаген, тем вьппе будет число ревертантов. Таким образом, количество реверсий служит мерой мутагенности проверяемого соединения. Сильные мутагены очень часто являются и потенциальными канцерогенами. Отбор ревертаитов Для определения числа ревертантов, появившихся в популяции клеток, подвергнутых действию проверяемого потенциального мутагена, необходимо иметь способ дифференцировки таких мутантов от спонтанно образуемых ревертантов.
В тесте Эймса для этой цели применяют синтетические среды с определенного состава. Одним из спосооов проведения эксперимента является нанесение клеток-мутантов Эймса на поверхность чашки Петри с плотной синтетической средой и немедленное введение в контакт с проверяемым соединением. Культуру микроорганизмов инкубируют до появления видимых колоний ревертантов.
Питательные среды, используемые в тесте Эймса, содержат следовые количества гистидина, позволяющие клеткам мутантов разделиться несколько раз, однако недостаточные для формирования колоний нормального размера. Это необходимо для того, чтобы испытываемые мутагены смогли бы подействовать и на стадии репликации ДНК (извеспю, что многие мутагены действуют на клетку именно на этой стадии ее развития). Таким образом, в синтетических средах с минимальнгям количеством гистидина клетки даже Луг -мутантов Эймса претерпевают несколько циклов редупликапии ДНК, а потенциальные мутации, если они происходят, представлены в «+» и « — » цепях делящейся ДНК. На чашках со средой после инкубации виден рост аух -мутантных клонов в виде слабого сплошного газона с образованием муарового налета, на этом фоне проявляются крупные колонии ревертантов (Ьуз'-колонии).
Проведение теста Эймса Тесты, проводимые в специальных лабораториях, лолжны строго соответствовать методике, приведенной Эймсом с коллегами, во избежание разночтения результатов экспериментов. Постановка тестов в стандартных условиях дает возможность сравнения результатов, полученных в разных лабораториях и в разное время, что важно для их независимой оценки и/или возможной перепроверки. Тест Эймса по полной схеме включает проведение экспериментов с различными мутантными щтаммами и предполагает наличие многочисленных контролей при различных концентрациях испытываемых соединений.
дж~г~: ~ ~«»»» «- шими методами проведения эксперимента. Задача не включает обучение методике тесп1рования по полной программе. В ней рассматривается только один мутант, тогда как тест Эймса предусматривает использование нескольких мутантов Х (урЛгглиггигл по гистидиновому оперону, полученных с помощью разных типов мутаций. В то же время все мутации имеют одну природу — это точечные мупщии со сдвигом рамки считывания илн мутации замены основания нуклеотидов. Каждый мутант предназначен для проверки различных мутагснов, вызывающих обратные мутации, которые приводят к появлению клеток дикого типа (ревертантов).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
