А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 118
Текст из файла (страница 118)
са11 становятся компетентными после обработки на холоду хлористым кальцием). Посев трансформированных клеток на селективные среды необходимо производить после определенного времени их инкубации в богатой питательной среде. В период такой инкубации в клетках-трансформантах происходит экспрессия полученных ими новых маркеров (генов) и они приобретают новый фенотип. У ряда микроорганизмов с естественной компетентностью внутрь клетки проникает только однонитевая ДНК, поэтому трансформация плазмидными ДНК, которые находятся в ковалентно-замкнутой суперскрученной форме, не осушествлается или осуществляется с низкой эффективностью.
Чтобы увеличить эффективность трансформации, следует предварительно получить протопласты клеток. При проведении трансформации у бактерий с естественной компетентностью необходимо учитывать факторы, влияющие на такое состояние: температуру, состав среды и ее рН, наличие определенных концентраций двухвалентных катионов. В последнее время распространение получш| метод трансформации, названный электрапарацией. Электропорация — введение ДНК в клетки с помощью электрических импульсов, создаваемых специальной аппаратурой. Злектропорация является перспективным методом, поскольку позволяет ввалить ДНК в клетки микроорганизмов, для которых системы трансформации неизвестны или осуществляются с низкой эффективностью.
400 Для различных микроорганизмов, у которых описан процесс трансформации, разработаны свои методы получения компетентных клеток и их трансформации. Ниже приведена методика приготовления компетентных клеток Е. сой штальма С600 и их трансформации плазмидными Д1-1К с высокой эффективностью. Выделение плазмндной ДНК нз клеток Е. сой. Имеется болыцое количество методов выделения препаратов плазмидпой ДНК, пригодной для трансФормации клеток Е.
сой без ее дальнейшей очистки. Одним из широко распространенных методов является метод выделения плазмьшных ДНК с помощью лизиса клеток при кипячении. Модифицированный вариант указанного метода приведен ниже. Клетки из ночной культуры Е сой (1,5 — 5 мл) осаждают центрифугированием при 15 тыс, хв течение 3 мин в пробирках Эппендорф. Супернатвнт пцательна сливают, а осадок ресуспендируют для лизиса в 350 мкл ВТЕТ-буфера (8%-я сахароза, 5%-й тритон Х-100, 50 мМ ЭДТА-)л)аь 50 мМ трис-НС1; рН 8,0). Добавляют 25 мкл раствора лизоцима в дистиллированной воде (10 мг/мл), перемешивают и инкубируют смесь при комнатной температуре в течение 5 мин.
Пробирки переносят в кипящую водяную баню и инкубируют в течение 40 с. Затем полученные лизаты центрифугируют при 15 тыс. 8 в течение ЗО мин и образовавшийся осалок (лизированные клетки, денатурированные белки и денатурированная хромосомная ДНК) удаляют чистой спичкой или переносят супернатант в чистую пробирку.
В пробирку к супернатанту добавляют 174 мкл 7,5 М раствора ацетата аммония и 300 мкл изопропилового спирта, перемешивают и инкубируют при -20'С в течение 15 мин. В этих условиях происходит преципитация ДНК, тогда как неденатурированные белки остаются в растворе. Преципитат осаждают цснтрифугированием при 15 тыс. 8 в течение 15 мин. Осадок дважды промывают 1,5 мл 70 %-го этанола, охлажденного до — 20 'С (этанол следует аккуратно добавлять в пробирку, не перемешивая осадка; центрифугирование проводят, как указано выше, в течение 10 мин). Полученный осадок (беловатый налет на дне пробирки) высушивают струей воздуха (можно использовать фен) и растворяют в 50 мкл ТЕ-буфера (10 мМ трис-НС1, 1 льМ ЭДТА-)л1аь рН 7,5).
При необхолимости раствор ДНК следует хранить при — 20 'С. Получение компетентных клеток Е. сей. Ночную культуру Е. сой штамма С600, выращенную без перемешивания, разводят в 20 раз теплой средой ЕВ (см. приложение 4) и инкубируют на качалке при 37 С в течение 90 — 100 мин. Клетки осаждают центрифугированием на холоде (6 тыс. 8, 10 — 15 мин), ресуспендируют в '/~ объема кулыуры 10 мМ раствора хлористого кальция при 4 'С, осаждают ценрифугированием на холоду (6 тыс. е, 10 — 15 мин) и ресуспендируют в 100 мМ растворе хлористого кальция при 4 С ('/„исходного объема).
Приготовленные таким образом клетки Е. сой сохраняют компетентность при их инкубации во льду в течение суток. Компетентность утрачивается даже при незначительном и кратковременнолс повышении температуры. Для более длительного хранения к компетентным клеткам добавляют глицерин до конечной концеьпрации 15%, разливают аликвоты по 0,2 мл, замораживают и хранят при -20 ...-80 'С. Трансформация компетентных клеток Е. сей. К 0,2 мл компетентных клеток Е. сой добавляют 1 — 10 мкл плазмидной ДНК (1 — 1ОО нг) и инкубируют во льду в течение 30 — 45 миц.
Затем клетки подвергают тепловому шоку 5 — 10 мин 401 при 42 'С. Добавляют к клеткам 0,5 мл среды ЬВ и инкубир)ют с аэрацией при 37 С в течение 2 ч. После инкубации высевают по 0,1 мл культуры на чашки с селективной средой и инкубируют в течение 16 — 24 ч. Конъюгация Процесс конъюпщии у бактерий обусловлен наличием.в клетках-донорах определенных плазмид, названных конъюгативными. Конъюгативныв нлазмиды солержат в своем составе 1га-гены. Эти гены кодируют формирование половых волосков-лилей, за счет которых образуются скрещивающиеся (коньюгирующие) пары, обеспечивающие коньюгативный перенос плазмидной или хромосомной ДНК в клетку-реципиент. Плазмиды, не способные к конъюгатнвному переносу, называются неканьюгативными. Первой описанной конъюгативной плазмидой, обеспечивающей конъюгацию у Е сад К-12, является наливай грактар Г (Ге«ШГгу).
Фактор Р, сушествующий в автономном состоянии, способен с высокой эффективностью передаваться из клеток-доноров реципиентам. При интеграции полового фактора в хромосолгу Г) сай образуются штаммы НГг (Ь)яЬ Ггег)пепсу оГ гссошЬ(пабоп), способные переносить в рецициентные клетки хромосомную ДНК. Реципиентные клетки, в которых происходит экспрессия генетического материала донора, называются трансканъюгантамт При проведении экспериментов по конъюгацни необходимо учитывать иидующее. 1. Перенос коньюгативной плазмиды и хромосомы донора в случае НГг-штаммов начинается с определенной точки на плазмиде, называемой опТ.
2. Перенос хромосомы донора происходит ориентированно, т.е. гены переносятся в той последовательности, в которой они расположены на хромосоме. Начало переноса связано с местом интеграции конъюгативной плазмиды в хромосому донорного ппамма и ее ориентацией. 3. Скорость переноса хромосомных маркеров зависит от температуры, но в стандартных условиях скрещивания ее величина постоянная.
Каждый генетический детерминант донора попалает в реципиентную клетку через определенное время после начала скрещивания. 4. Перенос является частичным. Во время передачи хромосомы происходят ее спонтанные разрывы, поэтому возникающие зиготы неполные, т.е. содержат только часть генома донора (мерозиготы). На использовании конъюгации основаны три метади генетического анализа у бактерий.
1. Определение частот рекомбинации между генетическими маркерами. Из-за очень высокой частоты кроссинговера маркеры, удаленные друг от друга на расстояние более 3 мнн переноса, ведут себя как несцепленные. Данный метод обладает высокой разрешающей способностью при анализе тесно сцепленных генов и при внутригснном картированни.
2. Определение последовательности генов на хромосоме по градиенту их передачи. 3. Локализация генов по времени их проникновения в реципиентную клетку — картирование методом прерывания конъюгации. Мобилизация некояъюгативных плазмид. Определенные неканьюгативные нлазмиды способны передаваться в реципиентные клетки в присутствии определенных коньюштивных плазмид. Данное явление получило название мобилизации неконыогативных плазмид.
Известны два основных механизма этого процесса. Во-первых, перенос нсконъюгативных плазмил осуществляется за счет продуктов гга-генов коньюгативных плазмид. Перенос по перволгу типу требует функционирования собственных генов пюЬ и начинается с собственного сайта оп Т. По такому механизму происходит, например, мобилизация плазмид Со1Е1 и ВБЕ1010. При этом механизме мобилизации перенос конъюгативной плазмиды в реципиентную клетку может и не происходить. Во-вторых, перенос неконъюгативных плазмид в реципиентные клетки может осушествляться вместе с конъюгативными плазмидами. В этом случае они составляют единую молекулу ДНК, объединяющую два или более реаликанав. По такому меха- 402 низму, например, происходит мобилизация широко используемых векторных плазмид серии рВК. Интеграция полового фактора в хромосому, приводящая к образованию Нй-штаммов, также является примером формирования коиитегратов.
В данном случае в единую молекулу ДИК объединены два репликона — плазмила (половой фактор) и хромосома. Мобилизация неконъюгативных плазмиа широко используется в практике генетических экспериментов. Этот метод менее труцоемок, чем трансформация, и, кроме того, позволяет вводить некоиъюгативные плазмнаы в клетки микроорганизмов, Ши которых не разработаны системы трансформации. Для мобилизации пеконъюгативных плазмид можно использовать трехродительские скрещивания, когда мобилизуемая и мобилизующая плазмилы находятся в разных доиориых штаммах.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
