А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 116
Текст из файла (страница 116)
Необходимо помнить, что УФ-лучи практически полностью поглощаются стек- 394 Таблица 35.! Свойства некоторых мутагенов, используемых для ицлукции мутаций у микроорганизмов Эффектив- НОСТЬ Механизм действия Мутаген Делеции, инверсии Средняя Средняя Низкая Низкая Средняя Очень высокая Высокая Низкая Средняя Радиация Рентгеновское излучение, быстрые нейт- роны УтР-облучеттие Химические агенты Аналоги оснований: 2-аминопурин, 5-бромурацил Гидроксиламин Азотистая кислота Нитрозогуанидин Зтилметансульфо- нат Акридиновые кра- сители, броми- стый этидий Биологические агенты Гены-мутаторы Преимутцест- венно разрывы хромосомы Димеризация пиримидиновых оснований Ошибки в регтликации ДНК Дезаминирова- ние цитозина Дезаминирова- нис цитозина и аденина Алкилирование оснований в репликацион- ной вилке Алкилироьание гуанидина Интеркаляция между основа- ниями во время репликации ДНК Нарушение процессов реп- ликации и ре- парации ДНК Тип мутации Транзиции, трансверсии„ делеции Транзиции Транзиции Транзиции, делеции Транзиции, трансверсии, с низкой частотой дслеции Транзиции, трансверсии Мутации со сдвигом рам- ки, неболь- шие вставки, делеции Транзиции, трансверсии Характерные Особенности Требует специального оборудования Высокая частота ин- дукции мутаций до- сптгается только в условиях низкой вы- живаемости, фото- реактивация должна быть предотвращена Слабый мутаген Слабый мутаген Высокал частота ин- дукции мутаций до- стигается только в условиях низкой вы- живаемости Опасен в обраще- нии, высокая частота шоричныхмутаций Опасен в обращении, по сравнению с нитрозогуанидином— меньше вторичных мутаций Зффектияен при излечитлтнтти клеток от плазмид Необходимо генети- ческое конструиро- вание штаммов Оконча!ше табл.
35. 7 Механизм лейстиия Эффекп!в- пасть Характерные Особенности Мутаген Тип муиции Трансг!Озирующи- еся элементы (15-элементы, транснозоны, фаг Мц и др.) Встраивание в ДНК Вставки, изредка делецин Необходт!мо генезз1- ческое конструиро ванне штал!Мов и/или векторов Очень высокая 396 лом, поэтому при облучении сусцензию вегетативных клеток или спор помещают в открытый сосуд, например чашку Петри. Чтобы исключить эффект экранирования, следует использовать суспензии с концентрацией не выше 5.
1О' клеток/мл и проводить облучение в буферных растворах. Летальный эффект УФ-лучей зависит от физиологического состояния клеток, прежде всего, от их возраста. Обычно в фазе экспоненциального роста культуры клетки более чувствительны к УФ-лучам, чем в стационарной фазе. Кроме того, облучение и дальнейшую инкубацию клеток микроорганизма следует проводить в условиях, исключаюших фотореактивацию, т.е. в темноте. Нил!розогуапидил.
)л(-л!етил-Н-нитро-)л(-нитрозогуанидин (НГ) является одним из самых мощных и широко применяемых мутагенов. Исходные растворы НГ готовят непосредственно перед использованием, растворяя его в соответствующем буфере (например, 0,1 М цнтратном буфере, РН 5,5) до концентрации 1 мг/мл. Рабочая концентрация НГ составляет обычно 50 — 500 мкг/мл.
Клетки (обычно из 5 мл культуры в экспоненциальной фазе роста) осаждают центрифугированием, промывают равным объемом цитратного буфера, ресуспенднруют в 5 мл буфера, добавляют НГ и инкубируют при 30 — 37'С в течение определенного времени. Время обработки подбирают предварительно таким образом „чтобы выживаемость клеток составляла примерно 50%. Клетки обрабатывают НГ в конечной концентрации 50 — ! 00 мкг/мл в течение 30 мин.
Обработанные клетки осаждают цснтрнфугированием, промывают 0,1 М К-фосфатным буфером (РН 7,0), чтобы удалить НГ. После этого клетки переносят в богатую питательную среду и инкубируют в течение ночи (12 — 16 ч). ° Азол!истая кислота. Раствор азотистой кислоты готовят непосредственно перед использованием, растворяя нитрит натрия в 0,1 М )л!а-ацетатном буфере (РН 4,6) до конечной концентрации 0,05 М. Клетки (обычно из 5 мл культуры в экспоненциальной фазе роста) осаждают центрифугированием, промывают равным объемом !л!а-ацетатного буфера, ресусцендируют в 1 мл раствора азотистой кислоты и инкубируют при 30 — 37 'С в течение определенного времени.
Время обработки подбирают предварительно таким образом, чтобы выживаемость клеток составляла примерно 0,01 — О,!%. Клетки обрабатывают азотистой кислотой в течение 10 — 20 мин. После окончания инкубации к ним добавляют 5 — 1О мл минимальной среды, чтобы остановить реакцию. Затем клетки осаждают центрифугированием, ресусцендируют в 10 мл богатой питательной среды и выращивают в течение ночи. ° Алкилилуюл!ие агенты.
Из алкилирующих соединений в качестве мутагена наиболее широко используют этилметансульфонат (ЭМС). Клетки (обычно из 5 мл культуры в поздней экспоненциальной фазе раста) осажлают центрифугированием и ресуспендируют в 2 мл минимальной питательной среды без источника углерода, содержащей 0„2 М тряс-НС1 (РН 7,5). К суснензии клеток добавляют 0,03 мл ЭМС, энергично перемешивают до его полного растворения и инкубируют цри 30 — 37 С в течение !в 2 ч (желательно на качалке). Затем к суспензии клеток добавляют 10 — 15 мл минимальной или богатой питательной среды и инкубируют в течение ночи.
Меры предосторожности при работе с мутагенами. Физические и химические мутагены не только увеличивают частоту мутаций, многие из них обладают канцерогенным действием, способным вызвать опухоли у млекопитающих. Кроме того, химические мушгены при попадании на кожу или внутрь могут привести к ожогам и отравлению. При работе с мутагенами следует строго соблюдать следующие правила: Любую работу с химическими мутагенами необходимо проводить в вытяжном шкафу, рабочая поверхность которого застелена фильтровальной бумагой.
° Руки должны быть зыцищены резиновыми или пластиковыми перчатками. ° Растворы музагенов нельзя засасывать ртом, следует использовать автоматические пипетки или пипетки с резиновой грушей. ° Растворы мутагенов нельзя сливать в раковину, лучше пропитать имп соответствующие твердые материалы (такие, как вермикулит) и поместить в герметичный контейнер, подобно другим опасным отходам. ° При работе с источниками УФ-лучей следует защищать глаза стеклянными очками. Экспрессия мутаций. Для проявления мутации необходимо, чтобы произошла репликация ДНК и изменение закрепилось в дочерней молекуле. Поскольку большинство мутаций являются рецвссивными, а клетка имеет в экспоненциальной фазе роста несколько копий хромосомы, то мутация проявится фенотипически через определенное время (сегрегапионный лат-период), в течение которого образуются клетки, солержащие только мугантные хромосомы (или ядра у эукариот).
Для фенотипического проявления мутации необходимо также прохождение транскрипции и трансляции. Микроорганизмы существуют не в виде отлсльных особей, а в виде популяций, поэтому для появления нового признака должно произойти, как правило, несколько клеточных делений (фенотипический лаг-период). Например, для проявления мутации устойчивости к фагу у Е. со11 необходимо, чтобы все рецепторы клеточной стенки заменились на мутантные. Это происходиттолькопосле 12дополнительных делений.
Следовательно, суспензию клеток микроорганизма, обработанную мутагеном,необходимо подрастить в течение определенного периода времени. Длительность фенотипического лагпериода зависит от скорости роста культуры и от особенностей ее развития. При склонности клеток к образованию устойчивых агрегатов (нитей, грозльев и т.д.) его длительность увеличивается. Таким образом, после подращивания клеток не все мутанты, которые обнаруживаются в культуре, являются независимыми, так как часть мугантных клеток происходит от одной исходной мутантной клетки в результкщ ее размножения. Поэтому для получения ряда независимых мутантов культуру после обработки мутагеном необходимо разделить на ряд субкультур и из каждой субкультуры отбирать только по одному муганту.
Отбор мутантов Прямой отбор мутантов. Метод прямого отбора заключается в высеве обработанной мутагеном суспензии на селективные среды и позволяет сразу получать колонии только мутантпых микроорганизмов, так как немутнровавшие микроорганизмы на таких срелах не вырастут. Метод првмого отбора обладает высокой чувствительностью и позволяет отбирать клетки определенного фенотипа, заланного условиями кулыивирования на селективной среде. В случае приобретения мутантами устойчивости к какому- либо веществу (антибиотику, токсину и т.д.) селективная среда должна содержать это вещество, подавляющее рост клеток дикого типа. Мутанты, способные использовать необычный источник питательных элементов (например, ксенобиотик), могут быть выделены на селеюгивных средах, в сосгав которых не входит традиционный для микроорганизмов дикого типа источник этого элемента.
Селективный агент добавляют в среду в оптимальной концепт.рации, подавляющей рост клеток дикого типа, но позволяющей расти устойчивым к данному агенту мутантам. Для этого предварительно определяют зависимость выживаемости микроорганизма от концентрации селективного агента. При отборе обратных мутщпов (истинных или супрессорных), у которых про- 397 изошло восстановление свойств дикого типа, например, от ауксотрофности по какому-либо фактору роста к прототрофности, необходимо использовать селективные среды, в которых этот фактор роста отсутствует. Высокая чувствительность метола позволяет выявлять редкие мушнтные клетки на фоне немугировавших клеток.
Непрямой отбор мутантов. Для непрямой селекции мутантов используют высевы на индикаторные среды и метод рсгпик (нли отпечатков). ° Использование индикаторных сред. Индикаторные среды, т.е. среды, на которых колонии микроорганизма с разными фецотнпами отличаются по внешнему виду, широко используются в генепгке микроорганизмов, в частности для непрямой селекции мутантов. Они позволяют различать выросшие колонии с разными свойствами по их внешним признакам, чаще всего гю изменению окраски. Индикаторные среды бывают двух типов: с индикаторам на использование субстрата и с хролюгегть~м субстратом. Первый тин содержит определенный субстрат, использование которого приводит к изменению рН, и индикатор, меняющий свой цвет в зависимости от кислотпости среды.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
