А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 111
Текст из файла (страница 111)
Попалая в окружающую среду вместе со сточными водами текстильного, красильного, отделочного производств, они накапливаются в биосфере. Даже небольшой концентрации красителя достаточно, чтобы сточные воды были сильно окрашены. Помимо негативного эстетического эффекта некоторые красители и многие продукты их неполной трансформации, особенно в аэробных условиях, оказывают сильное токсичное и/или канцерогенное влияние на живые организмы.
Деградация красителей химическими и физико-химическими мстодами является дорогостоящей и имеет массу других недостатков. Сушествснным недостатком аэробных технологий, особснно при обработке концентрированных сточных вод, яв.иются высокие энсргозатраты на аэрацию и проблемы, связанные с обработкой и утилизацией больших количеств образующегося избыточного ила, нмсюшсго очень низкую водоотдаюшую способность. Использование повсеместно применяемой технологии его длительной естественной сушки на иловых 377 плошалках приводит к отчуждению значительных территорий, а также к ухудшению экологической обстановки.
Аэробиые методы обработки сточных нод, загрязненных азокрасителями, крайне неэффективны. В то же время азокрасители могут подвергаться аниэробному восстаповлеиию с помощью неспецифических азоредуктаз различных групп микроорганизмов. Среди бактерий, проводящих такой процесс, — молочнокислые бактерии, Ргогеив зр., Епгегососсив вр., Авготопав Ьуг1горЫ1!а, Ягвргососсих /аеса1й, Вис11Ьа виЬВ1й, В.
руосуапвив, В. сетив, Рхеиг)отопавзр., Саргососаа са1ия, Еивобас1еггит зр., ВасРис. 33.1. Механизм восстановления !его г1вв 1Ьегаиаот(сгоп, Рврговггергососсив ргог1исгив, азосвязи в анаэробиых условиях ВиЬасгеггит Ь(7огте, ВЦЫобасгепит и~пи!!в, С1ообасгег зр. и т.д. СОО ОН При расщеплении азосвязи нарушается струк- о тура хромофориой части красителя, что приво- 1 дит к его обесцвечинаиию. НО ~ОН В результате восстановительного расщепления беизозт резорции флороглюиип нзокраситслсй в аиаэробных условиях образуются соответствующие ароматические амины (рис. 33.1), Рис.
33.2. Осионные иитермедиаты которые часто более токсичны, чем исходные сораспада ароматических соедине- единения. В аиаэробиых условиях при отсутствии иий н анаэробиых условиях такого окислителя, как кислород, разрушение ароматических веществ происходит более сложно, в несколько этапов.
Оснониые этапы процесса биодеградации — активироваиие бензсльиого кольца, его разрыв и образование С,- и С,-соединений. Активиронапие кольца может быть результатом реакций карбоксилироваиия, аиаэробного гидроксилировапия и образования КоА-тиоэфиров ароматических кислот. Существуют три различных пути конверсии ароматических соединений в аиаэробиых условиях, отличающиеся последними ароматическими иитермедиатами, такими, как беизоат, резорцин и флороглюцин (рис. 33. 2). В настоящее время наиболее распространенным среди микроорганизмов считается бепзоил-КоА-путь биодеградации ароматических вешесгн (через образование КоА-тиоэфира беизоата).
В этой реакции участвуют растворимые, иеспецифичиые, индуцибельиыс КоА-лигазы или КоЛ-трансферазы. При наличии заместителя иа беизольиом кольце далее может следовать восстановительное или гидролитическое его удаление. Беизоил-КоЛ затем подвергается серии последовательных восстановлений под действием беизоил-КоА-редуктазы и гидролитическому расщеплению образовавшегося производного циклогексана. Полученный иеароматический продукт н конечном счете окисляется с образованием ацетил-КоЛ. Микроорганизмы способны использовать широкий набор ароматических субстратов в нитрат-, сульфат-, железо- и карбоиат-восстаиавливаюших условиях (рис.
333). Использование в качестве акцешгора электронов Н' требует присутствия в системе сиитрофных партнеров, потребляюших молекулярный водород (метаиогепов, сульфидогеион или гомоацетогеион). На сегодняшний день из микроорганизмов, способных к биодеструкции ароматических соединений, в виде чистых культур выделены Рвеиг1отопав ар., ТЬаивга аготабса, Т.
сЫогобепго1са, 1)ввиуобасгег(ит ап!11п1, Агоагсив вгашб, Мавпегозрйту(ит зр., 0ву11а асЫоьюптпв, ЯЬодорввиг(стопах ра1иггги, $упггорЬизявп1тае и Х Ьияев111!. Значительно более успешно биодегралапию таких соединений осушсствляют аиаэробиыв микробиые сообигвства. В метаногенных условиях конечные стадии биодеструкции представлены археями родов МвгЬаповагс1па, МвгЬаповр!п11ит, МвгЬаповаеиг и МвгЬапобасгебигп. 378 ЗЧОг— нег' Зо„г- мг Рег' -н,з СОг Н. (. '"'"" НгО + ЗСоА — ЗН 9нгО 24 Н) — ~ - СОг + ЗАс — СоА 6СОг э ЗСоА-ЗН Рис. ЗЗ.З.
Схема анаэроб ной деградации ароматического вещества ЗАДАЧА. АНАЗРОБНАЯ БИОДЕГРАДАЦИЯ АЗОКРАСИТЕЛЯ АС!0 ОЯАНОЕ 7 МИКРООРГАНИЗМАМИ АКТИВНОГО ИЛА Основными способами удаления красителей из сточных вод служат ряд физико-химических методов (коагуляцня известью или солями алюминия, использование мембран, адсорбцня на угольной колонке, обратный осмос, химическое и электрохимическое окисление), а также аэробная и анаэробная биологическая обработка, причем наиболее эффективны именно микробиологические методы. Метаногенное сообщество активного ила способно минерализовать очень устойчивые вещества, содержащие в молекуле ароматические кольца. Используемый в задаче азокраситель АсЫ Огапйе 7 (рис.
33.4) производится в мире в промышленном масштабе, широко применяется в различных отраслях и поэтому попадает в окружающую среду в значительных количествах. Предлагаемая задача состоит из четырех опытов, каждый нх которых может быть выполнен как самостоятельное исследование. В качестве разрушаемого вещества можно использовать практически любой ксенобиотик„однако следует учитывать, что в этом случае период адаптации микроорганизмов активного ила к данному веществу бывает очень длительным (до нескольких лет). 379 Конверсия любого сложного органического вещества с получением метана требует наличия как минимум бактерий, обладающих гидролазами, микроорганизмов, осуществляющих брожение с образованием в конечном счете ацетата, углекислоты и водорода, и метаногенов. При деградации трудноразлагаемых соединений следует учитывать такое явление, как колегпаболизгв (в аэробных условиях — сооклслепие), когда проявление способносги к преобразованию сложной молекулы обусловливается наличием доступного источника энергии для поддержания жизнедеятельности, так как сам ксенобиотик не может использоваться микроорганизмом в этих целях.
Как правило, процесс кометаболизма характеризуется тем, что культура, трансформирующая чужеродное соединение, при этом не размножается и скорость процесса остается постоянно низкой, а продукты трансформации могут накапливаться в окружающей среде. Применительно к микробному сообществу именно такая стадия может быть лимитирующей для общего процесса полной минерализации ксенобиотика, и тогда внесение догюлнительного источника углерода и энергии может существенно повлиять на скорость биодеградации и время формирования стабильной высокоактивной ассоциации микроорганизмов. а1, й е 1 о 0 он во, йо, $0, сзо, 500 550 600 650 700 750 Рис.
33.4. Характеристика азокрасителя Ас1г1 Огапяе 7 и его формула ГЫюх~и: г ра бдардю «р «рб условиях и влияния на него ряда факторов (токсичности ксенобиотика, внесения дополнительного источника углерода, ингибирования ацетокластического метаногенеза).
Ход выполнения задачи Микробные ассоциации. В работе используют метаногенные анаэробные осадки любого происхождения (предпочтительно — активный ил очистных сооружений, обрабатывгиощих бытовые и промьппленные стоки). Среды и растворы. Для всех опытов применяют минеральную среду следующего состава (мг/л): 14Н4С! — 280; СаС!з. 2НзΠ— 10; К,НРО4 — 250; М8804 7НтΠ— 100; ЭДТА — 1; НаНСОз — 5000; дрожжевой экстракт — 100, концентрированный раствор микроэлементов — 1 мл. Такой раствор содержит (мт/мл): Н,ВОз — 0„05; ГеС1з 4Н,Π— 2; УпС1,— 0,05; МпС17 4НзΠ— 0,05; СнС17 2Н70 — 0,03; ()чН4),БеОз 5Н,Π— 0,05; А1С!з. 6Н70 — 2; )ч(С!з 6НзΠ— 0,05; Хат8еОз 5НзΠ— 0,1.
Минеральную среду кипятят для избавления от кислорода, затем охлаждают до комнатной температуры и разливают под током азота для предотвращения диффузии кислорода в среду. Среду разливают по 40 — 50 мл во флаконы объемом 120 мл, закрывают резиновыми пробками и зажимают алюминиевыми колпачками. Пузырьки со средой продувают азотом. Конечное давление во флаконах должно составить -1,6 ат. Пузырьки автоклавируют при 0,5 ати, рН среды после стерилизации равен 7,0. Все субстраты и добавки готовят в виде стерильных анаэробных концентрированных растворов и вносят по мере необходимости с помощью стерильных шприцев с соблюдением условий анаэробиоза.
Для приготовления концентрированного раствора азокрасителя его взвешивают в асептических условиях в рассчитанном количестве, переносят в стерильный пузырек, закрывают стерильной резиновой пробкой и зажимают алюминиевым колпачком. Во флакон добавляют стерильную дистиллированную воду до достижения нужной концентрации, продувают азотом и оставляют на 1 — 2 сут при комнатной температуре.
Концентрированныс растворы красителей могут образовывать осадок. Перед использованием такие распюры нагревают на водяной бане до полного растворения осадка, на 380 что требуется ст 2 до ! О мин. Концентрированные растворы ацетата, пирувата и бромзтансульфоновсй кислоты готовят на дистиллированной воде, продувают азотом и стерилизуют при 0,5 ати. Для разведения культуральной жидкости перед спектрофотометрическими измерениями используют нестерильный 50 мМ К-фосфатный буфер (рН 7,0), приготовленный стандартным способом. Методы определения параметров процесса Перед всеми измерениями культуральную жидкость освобождают от клеток цснтрифугированием при 15 тыс.
8 в течение 10 мин. Определение концентраций азокрасителя и наличия его ароматических производных. Оптимум поглощения красителя АсЫ Огап8е 7 — 490 нм. Резкое снижение высоты основного пика в сочетании с появлением и увеличением высот пиков, соответствующих ароматическим составляющим красителя, свидетельствует о разрыве азосвязи в молекуле красителя и появлении в среде более простых ароматических соединений', которые в свою очередь также могут быль полвержены дальнейшему расщеплению микроорганизмами активного ила. Фрагментация азокрасителя визуально выражается в постепенном обесцвечивании культуральной жидкости.
Спектрофотометрическое сканирование проволят в диапазоне длин волн 200 — б00 нм. Для анализа берут 100 мкл пробы жидкой фазы и доводят объем до 2 мл 50 мМ К-фосфатным буфером (рН 7,0). Измерения осу)цествляют на спектрофотометре «8)шпаро ()У-1202» (Япония), или аналогичном, в кварцевой кювете с 1= 0,5 см. Расчеты истинной концентрации С (мМ) азокрасителя проводят в соответствии с уравнением, полученным путем построения калибровочной кривой при содержании вещества от 10 до 500 мг/л: 2)Аг С= —, ХМ * где Ю вЂ” оптическая плотность данной пробы при 490 нм; )У вЂ” разведение; Х— тангенс угла наклона калибровочной кривой; /и — молекулярная масса азокрасителя (350,32).
Определение количества метана, углекислоты и молекулярного водорода. Метан и углекислота являются конечными продуктами биодеградации азокрасителя, а молекулярный водород — промежуточный продукт, регистрирующийся только на начальных гтадиях деструкции ксенобиотика, пока в микробном сообществе не сбалансирован обмен веществ. Концентрации газов определяют на газовом хроматографе ЛХМ 8 МД (модель 3, СССР) с катарометром, газ-носитель — аргон (скорость потока газа 20 мл/мин). Колонки длиной 2 м заполнены порапаком (;б. Предварительно измеряют давление в атмосферах во флаконах с помощью манометра, на входном отверстии которого укреплена игла от шприца.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
