А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 113
Текст из файла (страница 113)
Выявленные ароматические иптермедиаты определяют с помощью ВЭЖХ и по максимумам поглощения при спектрофотометрии. Описывают характерные культуральные свойства и микроскопическую картину сообществ из разных вариантов. Полученные данные представляют в виде таблиц, спектров азокрасителя и ароматических производных„а также графиков зависимости содержания всех вышеперечисленных веществ (мМ) и биомассы (мг/л) от времени (сут). Делают выводы о биологической природе процесса, роли адсорбции, послсдователыюсти появления и химической структуре ароматических интермедиатов, а также о возможных механизмах конверсии азокрасителя.
Анализируют соответствие различных фаз пррцссса биодеструкции азокрасителя изменениям в микробном составе анаэробной ассоциации. В эксперименте по изучению влияния дополнительного источника углерода (пирувата) сравнивают те же параметры, что и в предыдущем эксперименте, но во флаконах с активным илом и азокрасителем с пируватом или без него. Данные представляют в виде таблиц и графиков, делают выводы об изменении хода процесса биодеструкции красителя в присутствии легкодоступного субстрата (увеличении скорости, изменении состава и соопюшения продуктов, приросте биомассы, изменении микроскопической картины активного ила). Для накопления и опредсления интермедиатов распада азокраситсля проводят эксперимент по элиминированию последней стадии биодеградации в анаэробных условиях — метанообразования.
Во флаконы с активным илом и азокрасителем, содержащие и не содержащие дополнительный источник уг- 384 пыта; АИ активный ил, АК азокраситель; Ац— ацстат; П вЂ” цирувап БЭСК вЂ” бромзтансульФоновая кислота. Скобки и рамки объединяют варианты, учитываемые в различных экспери- ментах Аи+Ац АИ+Ац АИ+Ац (6 ммоль/л) (6 ммоль/л) (6 ммоль/л) + АК ь АК ь АК (2,1 ммсль/л) (2,3 ммоль/л) (3,5 ммоль/л) 385 13 нелаеоа лерода пируват, вносят ингибитор метанообразования БЭСК в концентрации 45 мМ. За процессом следят по виду спектра культуральной жидкости, хроматограммы ВЭЖХ, накоплению интермедиатов в жидкой фазе. Определяют морфологические и культуральные изменения в разных вариантах. Результаты представляют в виде таблиц и графиков.
Уточняют данные о химической структуре кольцевых и линейных интермедиатов. Делают выволы о влиянии метаногенной стадии на скорость процесса биодеградации азокрасителя в условиях, когда он является единственным источником углерода и энергии или имеется также другой легкодоступный субстрат. Исследование по токсичности лзокрасителя проводят на фоне стандартного метода определения ацетокластнческой метаногенной активности анаэробной биомассы. Во все пузырьки вносят раствор ацетата натрия до конечной концентрации 6 мМ в качестве основного субстрата и азокраситель с конечной ко~щентрацией 0,7; 1,4; 2,1; 2,8 и 3,5 мМ. В качестве контрольных используют пузырьки без добавления азокрасителя. Через каждые 24 ч (48 ч) измеряют концентрацию метана в газовой фазе, а полученные результаты представляют в виде графика зависимости количества метана от времени. Измерения сопровождают приготовлением фиксированных окрашенных препаратов культуральной жидкости.
Значение ацегокластической активности анаэробного нла рассчитывают по тангенсу угла наклона линейного участка этой кривой. За 100% активности принимают тангенс угла наклона линейного участка кривой зависимости концентрации метана от времени в эксперименте без добавления азокрасителя. Поскольку скорость разложения самого азокрасителя в этих условиях существенно ниже скорости ацетокластической реакции, его вкладом в образование метана можно пренебречь. Результаты представляют в виде графиков зависимости ацетокластического метаногенеза от времени для разных концентраций красителя, а также кривой зависимости образования метана (%) от концентрации азокрасителя (мМ). Определяют ЛД,„ для данного азокрасителя н делают вывод о его токсичности по отношению к метаногенной активности анаэробного ила.
Анализируют изменение микроскопической картины в зависимости от концентрации красителя и делают вывод об изменении микробного состава активного ила при увеличении «лавления» ксенобиотика. Материалы, оборудооаиие, иоеуда, реактивы Спектрофотометр «Яшпабхц 1Л/-1202» (Япония) нли аналогичный, кювета кварцевая с 1 = 0,5 см и кювета стеклянная с 1 = 1,0 см; шзовый хроматограф ЛХМ 8 МД (модель 3, СССР) с катарометром; газовый хроматограф «Сйплп-5» (ЧССР) или аналогичный с пламенно-ионизационным детектором; хроматограф ВЭЖХ Оц Ропг (США) или аналогичный; световой микроскоп с масляным иммерсионным объективом 90Х; баллон с аргоном (азотом); щипцы для зажимания алюминиевых колпачков; центрифуга с гнездами для пробирок Эппендорф; манометр с иглой.
Флаконы на 120 мл с герметичными резиновыми пробками и алюминиевыми колпачками — 26; пробирки химические мерные с притертыми пробками на 5 — 10 мл — 90 (45); пластиковые пробирки Эппендорф на 2 мл с крышечками или аналогичные — 300 (150); пипетки на 1 — 2 мл— 540 (270), на 0,1 мл — 25 (13); шприцы на 1 — 2 мл (лучше одноразовые) — 300 (150); газовый шприц на 0,5 — 1,0 мл — 1; предметные стекла лля микроскопии — 50 (25). Минеральная среда — 1100 мл; концентрированные растворы: азокрасителя — 50 мл, пирувата натрия — 1О мл, ацетата натрия — 20 мл, бромэтансульфоновой кислоты — 10 мл; 50 мМ К-фосфатный буфер (рН = 7,0) — 100 мл; растворы А и Б для определения аммония — по 30 мл; растворы А, В, С для определения сульфида — 30, 30 и 1,5 мл соответственно; 3 )Ч о1аОН вЂ” 10 мл; реактив Бредфорд — 100 мл; краситель метиленовый синий для окрашивания микроскопических препаратов -30 мл; иммерсионное масло кедровое -5 мл.
План выполнения задачи Занятие 1. Подготовка и стерилизация минеральной среды. Расчет необходимых количеств веществ для приготовления концентрированных растворов азокрасигеля и добавок. Приготовление и стерилизация растворов добавок и инструментов (4 ч). Приготовление концентрированного раствора азокраснтеля (48 ч). Занятие 2. Приготовление реактивов, растворов и стандартов для определения различных веществ (см.
с. 381). Построение калибровочных кривых и снятие спектра раствора азокрасителя (4 ч). Занятие 3. Засев флаконов активным илом, внесение субстрата и необходимых добавок. Отбор проб в нулевой точке и проведение всех необходимых определений. Опи- 386 саине культуральных признаков и приготовление фиксированных окрашенных препаратов (4 ч). Инкубация посевов (20 суг). Занятия 4 — 23 (4 — 13). Отбор проб каждые 24 ч (48 ч).
Описание культуральньтх признаков и приготовление фиксированных окрашенных препаратов. Проведение необходимых определений. Занесение результатов в таблицы. Закладка на хранение проб для ВЭЖХ (4 ч). Занятие 24 (14). Отбор и приготовление стандартов для ВЭЖХ. Проведение ВЭЖХ для всех хранящихся проб (8 ч). Занятие 25 (15).
Оформление результатов (4 ч). Глава 34 ИЗУЧЕНИЕ ЯВЛЕНИЯ ДИССОЦИАЦИИ У МИКРООРГАНИЗМОВ Диссоциация — это явление морфофизиологической гетерогенности популяции микроорганизмов, которая визуально выражается в развитии морфологически разных колоний при рассеве чистой культуры. На самом деле такая гетерогенность лшкрабной популяции затрагивает не только морфологические, но и физиолого-биохимические, и генетические признаки. В отличие от спонтанных мутаций эти изменения имеют постоянный обратимый характер и более высокую частоту (-10 '). Традиционно по морфологии различают три вида колоний: К вЂ” шероховатые, 5 — гладкие, М вЂ” слизистые.
Механизм этого явления еще не раскрыт полностью, и, более того, вопрос этот на протяжении многих лет остается дискуссионным, однако в практике научных исследований с ним сталкивается практически каждый, кто работает с микроорганизмами. Первоначально явление диссоциации было отмечено у патогенных микроорганизмов Яайюае!!а, Бее!!а, Е. сей и в связи с разными фазами протекания болезни было названо «вариацией фаз» (5 — вирулентный вариант, преобладаег в эпидемической фазе, К вЂ” в постэпиаемической). Диссоциация, безусловно, связана с изменениями в геноме. Итак, если после выделения чистой культуры из отдельной клетки в дальнейшем вырастают разные колонии, то это диссоциация.
Колонии по диаметру различаются, но клеток в колониях одинаковое количество, и они по-разному упакованы. При этом в каждой колонии уже есть клетки всех трех типов. В природе обычно какой-то из диссоциантов преобладает, но присутствуют все три варианта. Различия в виде колоний обычно выявляются только на богатой углеводами среде. Различия на клеточном уровне лежат в способе расхождения делящихся клеток (образуются либо цепочки, либо «палисадные» У-образные формы). У диссоциантов одна из главных первопричин вариаций — различия в клеточных оболочках (капсула+клеточная стенка), в частности разная толизина и химический состав капсул (например, переход 5-варианта в Р;вариант связан с потерей О-антигена).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
