А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 110
Текст из файла (страница 110)
Используют ранее подготовленную 2%-ю суспензию трипсинизированных эритроцитов в 0,05 М К-)л(а-фосфатном буферном растворе, рН 7,4, приготовленном на физиологическом растворе — 0,9%-й !л(аС1 (буфер Ф). В иммунологические плашки вносят по 100 мкл такой суспензии и по 1ОО мкл изучаемых растворов, а также, где необходимо, буфера К, чтобы конечная концентрация белков в смеси составила 5, 10, 20, 50 и 100 мкт/мл. Эти разведения делают' из исходных разведений с наибольшей концентрацией белков — 400 мкг/мл, побы в инкубационной смеси преобладал буфер Ф.
Измеряют при Х = 600 нм исходную плотность суспензии эргпроцитов на плашечном спектрофотометре, а также через 20 и 60 мин стояния плашки при комнатной температуре на строго горизонтальной поверхности. Затем микропипеткой осторожно собирают жидкость над осевшими эритроцитами (по 100 мкл) и измеряют ее поглощение при Х = 600 нм. Если в жидкости появляется раствор гемоглобина, это значит, что часть эритроцитов лизировалась — свидетельствует о присутствии в изучаемых растворах Суг-белка с литической активностью.
Минимальной агглютинирующей концентрацией является та концентрация белка, которая вызвала реакцию оседания эритроцитов. Электронно-микроскопическое изучение влияния полифункциональных белков кристаллов иа эритроциты и клетки микрококков. Отбирают контрольные клетки микрококков, а также эритроциты до начала их использования в опыте, а также эти клетки в каком-либо варианте после опыта, где наглядно определена антибиотическая и лектинподобная активности изучаемых белков. Готовят препараты этих клеток для просвечивающей элек|ронной микроскопии (негативное контрастирование).
Для этого каплю суспензии клеток наносят на сетки, покрытые формваровой пленкой, через 30 с лишнюю жидкость убирают фильтровальной бумагой. Затем наносят на сетки на 1 мин 2%-й раствор натриевой соли фосфовольфрамовой кислоты (рН 7,0 — 7,2), убирая лишнюю жидкость также с помощью полоски фильтровальной бумаги. Все препараты на сеткахпросматриваютвтрансмиссионном электронном микроскопе, например ЛЕМ вЂ” 100В (фирма «Лео1еч Япония). Оформление результатов. Результаты оформляют в виде таблиц значений антибиотической и лсктинподобной активности изучаемых растворов белков в присутствии разных сахаров. Проводят сравнительный анализ влияния сахаров на активность растворов в отношении эритроцитов и клеток прокариот.
Анализирукп микроскопическую картину разрушения клеток под действием растворов изучаемых белков. Материалы, оборудоваиие, посуда, реиктивы Реактивы„указанные в методической части; ламинар; световой и электронный микроскопы (лаборатория электронной микроскопии); плашечный спектрофотометр; посула; микропипетки; пробирки Эппендорфа; плашки стерильные. 375 План выполнения задачи Для выполнения задачи требуется примерно 7 занятий.
Занятие 1. Подготовка посуды, питательных сред. Лцетатная селекция кристаллообразующих бактерий. Занятие 2. Посев кристаллообразуюших и тест-культур. Подготовка реактивов. Занятие 3. Выделение белков из кристапса. Подготовка суспензий клеток тест-микроорганизмов. Занятие 4. Постановка опытов по определению антибиотической и агглютинируюшей активности изучаемых белков. Занятие 5. Определение антибиотической активности белков методом диффузии в ыар. Предварительный анализ полученных результатов.
Занятие б. Электронная микроскопия клеток. Занятие 7. Одюрмление результатов, их анализ и обсуждение. Глава 33 АНАЭРОБНАЯ БИОДЕГРАДАЦИЯ АЗОКРАСИТЕЛЕЙ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ Сброс огромного количества бытовых и промышленных отходов создает избыточную нагрузку на природные экосистемы, в основном из-за созданных человеком соединений, которые в обычных условиях нс разрушаются. Эти чужеродные вещества — ксгнобиотики — имеют уникальную биологическую активность даже в небольших концентрациях.
Многие из них обладают значительной стабильностью, и для их полного разложения требуются столетия. Происходит непрерывный перенос таких веществ по пищевым цепям и их накопление на конечных этапах, к которым относится и человек. Огромное число ксенобиотиков имеет техногснное происхождение и многие чрезвычайно токсичны, проявляют мутагенную и канцерогенную активность.
Самоочишение природных экосистем связано прежде всего с огромным потенциалом микробной активности. Производственные процессы очистки и переработки отходов деятельности человека также основаны на понятии биодеградации, т. е разрушении вещества с помошью биологической акгивностн, большую часть которой проявляют именно микроорганизмы.
К биодеградаш1и относят реакции незначительных изменений молекулы (трансформацию), распад сложной молекулы до более простых соединений (фрагмгнтацию) и разложение сложного вешесгва до самых простых (СОм НзО, ННв СН4 и т.д.), или полную минерализацию.
Использование биологической активности для удаления загрязняюших вешеств из окружающей среды называют биоремедиацией. Для успеха таких процессов необходимо сначала нштти соответствующую активность, а затем разными методами се стимулировать и создать по возможности оптимальные условия для проявления. Только микроорганизмы могут помочь справиться с антропогенным загрязнением, так как у них огромный потенциал и лабильный обмен, позволяющий воздействовать гиже на необычные, искусственно созданные субстанции, да при этом еще давать полезные продукты (газы, металлы, растворителя и т.д.). Здесь огромное поле деятельности д~и работы скорее не индивидуальных микроорганизмов, а микробных сообществ (например, метаногенных). В таком сообществе микроорганизмов возникают прочные трофические связи, и часто субстрат может быть расщеплен до простых веществ именно группой микроорга- 37б низмов, а не отдельными ее членами, которые в виде чистых культур этот субстрат вообще не могут использовать из-за энергетических барьеров.
При таких условиях возникает синтрофия — полная взаимозависимость друг от друга в пищевых потребностях, которая более облигатна в анаэробных условиях. Как правило, для нормального функционирования анаэробной пищевой цепи необходим межвидовой перенос некоторых интермедиатов, обычно молекулярного водорода, иногда ацетата, формиата, так как эндэргонические реакции начальной фазы деградации требуют отвода Нэ Обычно эти ассоциации оформлены структурно в виде гранул, хлопьев, сложных биопленок, что позволяет микроорганизмам, ответственным за каждую стадию дсградации сложных соединений, находиться пространственно близко друг к другу для облегчения межвидового переноса интермедиатов.
Структурно оформленные сообщества называют консорциумами. Ешс 15 — 20 лет назад считалось, что органические соединения, содержащие ароматические и конденсированные циклические структуры, в анаэробных условиях микроорганизмами не используются. В настояшее время убсдительно гюказана способность анаэробных микроорганизмов к деградации таких ксенобиотиков. Когда процесс проводит не индивидуальный микроорганизм, а структурированная микробная ассоциация, это позволяет увеличить эффективность и глубину деградации сложных органичсских соединений в анаэробных условиях, а также получить полезные конечные продукты (например, биогаз в метаногенном сообшестве). Пока механизмы этих процессов, видовой состав сообществ и взаимодействие микроорганизмов в них изучены мало, поэтому массовое применение биоремедиации весьма ограничено. Однако разнообразие метаболичсских путей в микробных сообшествах позволяет надеяться, что в перспективе возможно создать ассоциации, способные разрушать полный набор синтезированных человеком соединений, тем самым возврашая в глобальные циклы элементов активные формы углерода, азота и т.д.
Химическая и нефтехимическая промышленность — основной источник токсичных и устойчивых к биоразложению загрязнений. Одной из наиболее распространенных и широко используемых групп таких загрязнений являются красители — синтетические органические вещества, проявляюшие большое разнообразие структур и используемыс для различных целой в текстильной, косметической, бумажной, пищевой и фармакологической промышленности. Самую большую группу синтстичсских красителей составляют азокросшлели. Благодаря своему химическому строению азокрасители поглощают свет в видимой области спектра.
Химическая структура азокрасителей характсризуется наличием одной или более азогрупп (-г1 = )Ч-). Азогруппа соединена с бснзольным или нафталиновыми кольцами, которые могут содержать большое количсство различных заместителей, таких, как хлор (-С1), метил (-СНз), нитрогруппу (-гчОз), аминогруппу (-ННз), гидроксил (-ОН) и карбоксильную группу (-СООН). В азокрасителях в качестве заместителя часто встречается сульфогруппа (-ВО,Н). Азокрасители, содержащие такой заместитель, называются сульфоазокраситепями. В процессе производства и использования азокрасителей примерно 1Π— 50% попадает в окружаюшую среду.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
