А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 105
Текст из файла (страница 105)
Фарфоровые чашки с растворами актиномицннов в этилацегате оставляют в вытяжном шкафу до полного испарения эфира. Оставшийся на стенках чашки красный осадок предсташшет собой сырец актиномициновых антибиотиков. Перед хроматографированием осадок растворяют в 2 — 4 мл ацетона. Хроматографнрованне. Лктиномициновые антибиотики делят на отдельные компоненты, отличающиеся по аминокислотным остаткам хроматографированием на бумаге. Система растворителей лля хроматографии актиномицинов готовится в соотношении бутилацетат: дибутиловый эфир: 10%-й водный раствор салицилово-кислого натрия (1: 1: 2).
Растворители встряхивают в делительной воронке и после разделения сливают в отдельные Флаконы нижнюю водную и верхнюю органическую фазы. Полосу хроматографической бумаги (ленинградская медленная) размером 20 х 50 см смачивают в нижней фазе растворителей, слегка подсушивают и на влажную бумагу с помощью капилляров наносят ацетоновые растворы полученных антибиотиков и стандартного препарата актиномицина.
Каждый раствор наносят узкой полосой длиной 2 см, расстояние между полосами нанесения разных образцов — 3 см, от краев бумаги — 2 см. При высокой концентрации антибиотика в растворе достаточно нанести его на бумагу один раз, при низкой — раствор антибиотика после подсушивания на бумаге следует нанести несколько раз. Верхнюю часть бумаги помещают в органическую фазу растворителей и нисходящую хроматограмму оставляют в камере на ночь. Хроматограммы с разделившимися на компоненты антибиотиками высушивают в вытяжном шкафу и анализируя:т. Лктиномнцины — окрашенные вещества, поэтому специального проявления хроматограмм не требуется.
Анализ хроматограмм антибиотика. При хроматографированни стандартный препарат актиномицинов группы С делится на три компонента, различающихся по остаткам Р-аминокислот во втором положении полипептидных цепей. Менее подвижный компонент С~ содержит два валина, С, — один валин и один изслейцин, более подвиж- 358 ный компонент С, — два остатка изолейцина. Под действием экзогенных аминокислот изменяется количественное содержание названных компонентов или образуются новые, отдуляюшиеся на хроматограмме от известных. Подсчитывают количество компонентов (отдельных актиномицинов), на которые разделился в каждом случае образец антибиотика, измеряют пути прохождения и вычисляют Ягкажлого компонента. За Яг актиномицннов принято считать отношение пути, пройденного данным актиномицином, к пути, пройденным актиномицином Сь )1гкоторого принимают за 1.
Сравнение ведется со стандартным препаратом актиномицина. Вырезают дорожку, пройденную каждым образцом антибиотика, и отрезают две узкие полоски, по 0,5 см шириной, по краям дорожки. Центральную широкую полосу используют для колориметрического измерения количества каждого из компонентов. Для этого вырезают кюхдое пятно, разрезают на мелкие полоски и помешают в пробирку с 5 мл эганола.
После экстракппи веществ их количество измеряют на ФЭК при Х = 400 нм, кювета 0,5 см. Сумму экстинкций всех компонентов принимают за 100%, по величине экстинкции каждого компонента вычисляют его процентное содержание в антибиотическом комплексе. Одну из отрезанных узких полосок хроматограммы используют для проверки антимикробных свойств методом биоавтографии. Для этого полоски хроматограмм опьпных и стандартных актиномицинов наклалывают на агаровую пластинку с тест- микроорганизмом (готовится, как описано в разделе «Биологическое определение количества антибиотика»). Пластинку ставят на сутки в термостат при 30 С и затем измеряют зоны подавления роста тест-микроорганизма (мм).
Вторую узкую полоску хроматограммы используют для проверки характерного для актиномицинов изменения окраски в зависимости от величины рН среды: в кислой среде — увеличение яркости окраски, в шелочной — обесцвечивание. Г1слоску хроматоциммы последовательно держат над парами соляной кислоты н затем погружают в 5 — 10%-й раствор щелочи. Результаты представляют в виде табл. 30.3. Из проведенных анализов делают выводы: 1) идентификация и свойства полученных антибиотиков; 2) компонентный состав антибиотиков; 3) влияние добавок аминокислот на состав антибиотиков. Тонкослойная хроматография актнномнцннов. Хроматографическое разделение актиномицинов также можно проводить на пластинках для тонкослойной хроматографии НР-Т1.С-А!цГо!(еп К!оке!де! бО фирмы Метек (ФРГ).
Разделение ведут в восходящей системе растворителей бензол: ацетон (2: 1). В стеклянный цилиндр высотой 20 — 25 см и диаметром 1Π— 15 см наливают слой растворителей высотой 0,5 см. На пластинку на расстоянии 1 см от края наносят капиллярами точки стандартного и исследуемых растворов актиномицинов. Диаметр Таблица 303 Характеристика антибиотиков, образуемых при росте стрептомнпета па разных средах 359 пятна нанесения — 2 мм. Пластинки ставят в цилиндр с системой растворителей и сверху герметически закрывают. Хроматографическое разделение веществ происходит в течение 30 — 40 мин.
Материалы, оборудоваиие, аосуда, реактивы Микроскоп; ФЭК; термастат; качалка; хроматографическая камера; хроматографнческая бумага; делительные воронки; капилляры; фарфоровые чашки; чашки Петри; качалочные колбы; лотки для тест-организмов; предметные стекла; пробирки; пипетки; мерные колбы на 50 и 100 мл; этанол; ацетон; этилацетат; бугилацетат; либутиловый эфир; салицилат !ча; соляная кислота; 10%-й раствор 1чаОН; метиленовый синий по Леффлеру; фиксатор Карнуа; стандарт актинолгицина 500 мкг/мл„реактивы для приготовления сред. Тест-организмы. План выполнения залачи Для проведения задачи необхолимо 35 — 38 ч. Занятие 1. Приготовление сред и посуды для стерилизации. Посев стрептомицета в качалочные колбы со средой У4а 3 (посевной материал). Занятие 2. Посев стрептомицета в качалочные колбы со средой 4.
Отбор нулевой пробы. Приготовление чашек Петри со средой 2. Приготовление бумажных фильтров. Построение калибровочной кривой для стандартного раствора актиномицинов. Внесение стерильных растворов аминокислот в 24- и 43-часовую культуру стрептомицета и отбор проб из культуры. Занятия 3 — 4. Отбор проб из культуры растущего стрептомицета. Посев стрептомицета штрихом на чашки Петри со средой 2. Взвешивание бумажных фильтров. Фиксация и окраска мицелия стрептомицета на предметных стеклах и просмотр препаратов под микроскопом. Зксгракция антибиотика из 96-й часовой культуры стрептомицета. Занятие 5. Фильтрование проб через доведенные до постоянного веса бумажные фильтры.
Определение количества антибиотика колориметрическим и биологическим методами. Звюпие 6. Измерение зон подавления роста тест — микроорганизма на лотках; построение калибровочных кривых и расчет количества антибиотика. Взвешивание булыжных фильтров с мицелием. Посев тест-организмов к шчриху стрептомнцета. Р! остановка хроматограмм. Занятие 7 — 8. Анализ хроматограмм. Определение количества компонентов антибиотиков. Биоавтография. Проверка чашек Петри со штрихом стрептомнцета и тест- организмами. Занятие 9.
Анализ данных по биоавтографии. Оформление результатов, обсуждение, зачет. Глава 31 МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ОБРАЗОВАНИЯ ВИТАМИНОВ МИКРООРГАНИЗМАМИ Витаминами называют низкомолекулярные органические соединения, обладающие высокой биологической активностью и поэтому необходимые живым организмам в очень небольших количествах. Человеку в сутки необходилю витаминов от нескольких микрограмм до нескольких десятков миллиграмм. Многие микроорганизмы также нуждаются в витаминах лля сво- Таблица 31.1 Количество различных витаминов (мкг/л питательной среды), необходимое для роста большинства микроорганизмов (по Н.Д.
Иерусалимскому) его развития и роста. Витамины влияют на рост и размножение микроорганизмов, на процессы метаболизма, на строение югеткн и другие свойства. Они служат кофактора- ми многих ферментов. Активность некоторых витаминов и витаминоподобных соеди- нений, а также их свойства показаны в табл. 31.1, 31.2. Таблица 31.2 Свойства различных витаминов и близких к иим веществ Алсорбпия углем Разрушение нагреванием Растворимость Название вещества в мзде Са-пантатенат р-Алании Никотиновая кислота 361 Тнамин Рибофлавин Холин Фактор У в щелочном раство иге в растворах кислот при рН 3 — 4 при РН 7,0 Р Л У Разрушение в вакууме в виле светом эфиров в спир- 70УЬ-и в эфире, хлоро- Форме Окончание таба.
3!.2 Разрушение нагреванием Адеорбцвя углем Растворимость Летучесть в вакууме в виде эфиров Разрушение светом Название вешеетва эфире, хлоро- форме в спир- те 70%-м в ше- дочвом растворе при рн 3 — 4 в растворах кислот прв рН 7,0 в воде Пиридоксин Б ногин г-Инознт гроленая кислота р-Аминобен- зойная кислота Гемин В лочной сре- де Пуриновые основания В кис- лой сре- де Урания ЗАДАЧА 1 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА Взг Витамин Вш обнаружен в растительных клетках, органах и тканях животных, но к самостоятельному синтезу этого соединения способны только микроорганизмы. Наиболее активными продуцентами витамина являются представители рода Ргор)опгбасуепищ, термофнльные штаммы рода Васйие, ряд штаммов рода М)сготапозрога, Рзеис7отопае с7епйпЯсапз и метаногенные архон. Витамин В и применяют прн лечении ряда заболеваний, а также для обогащения кисло-молочных продуктов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
