А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 101
Текст из файла (страница 101)
Исходная концентрация стандартного раствора содержит 30 мкг/мл тгпозина. Антибиотик сначала растворяют в 1 — 2 каплях спирта и далее доводят дистиллированной водой до нужного объема. Параллельно 341 Таблица 29.1 Схема определения антибиотической активности Номер пробирки 1 — 3-и ряды пробирок 4 5 100 мл МПБ+ 0,5мл спор Л. зиЫИ(з 1мл 1мл 1 мл 1 мл 1 мл 1 мл 1 мл 1 мл 48-часовой пробы культуральной жидкости добавляют в пробирку 1 и переносят последовательно в следующие пробирки 1 мл 1 мл Полученные разведения культуральной жидкости (коэффициент разведения) 32 448 раз ставят два контроля: 1 мл стерильного МПБ (контроль среды); 1 мл МПБ + тест- культура (контроль роста тест-культуры). Пробирки помещают в термостат на 24 ч при ЗО'С.
Далее измеряют оптическую плотность тест-культуры при Х = б50 нм в кюветах 1 см или визуально сравнивают рост тест-культуры в контроле (ряд разведений исходного стандартного распюра тилозина) и опыте (рял разведений культуральной жидкости). Совпадение оптической плотности между пробирками разведений культуральной жидкости и стандартного раствора зилозина позволяет определить С (концентрацию антибиотика в культуральной жидкости) с учетом соответствующих разведений: С(мкг/мл) = ' К Материалы, оборудование, посуди, реактивы Спектрофотометр; центрифуга; ультратермостат; водоструйный насос; качалочные колбы — 2; пробирки обычные — 70; пробирки обычные стерильные — 8; пробирки мерные на 25 мл — 2; пипетки на 2 мл и на 10 мл — по 10; реактивы для приготовления сред, определения белка, протеолитической н амилолитической активности, тилозина (см.
текст). План выполнения задачи Для выполнения работы необходимо Зб — 40 ч. Занятие 1. Приготовление и стерилизация питательных сред и посуды. Подготовка посевного материала Х /гад/ае. Занятие 2. Посев культуры Х/галие в основную и опытную среды. Построение калибровочной кривой для определения белка в культуральной среде по методу Бред- 342 где К вЂ” коэффициент разведения культуральной жидкости отобранной пробы, в которой отсутствует рост тест-культуры; К вЂ” коэффициент разведения стандартного раствора тилозина, в которой отсутствует рост тест-культуры; С вЂ” концентрация исходного стандартного раствора тилозина (мкг/мл) или С (мкг/мл) = (Юк, где ЫЗ— летальная доза стандартного раствора тилознна (мкг/мл), вызывающая подавление роста тест-культуры.
Полученные результаты оформляют в виде таблицы (табл. 29.2) и графиков. На графиках должны быль представлены: кривая роста культуры, содержание белка в культуральной жидкости, удельная протеолитическая и амилолитическая активности, антибиотическая активность. Делают вывод о ферментативной и антибиотической активности Х /гасЧае в зависимости от фазы роста культуры и состава питательной среды. Таблица 29.2 Протеолитвческая, амилолитическая и аитибиотическая активность Ю. /гаЖве при росте иа среде с соевой (кукурузной, рыбной и т.д.) мукой Время культивирования, ч Показатель 24 144 Биомасса, ед. опт.
нл. Содержание белка в культуральной жидкости, мг/мл Прстеолитическая активность культуральной жидкоспи, Д/мин. мл Удельная протсолитнческая активность, 11/мнн мг белка культуральной жидкости Амилолитическая активность культуральной жидкости, Б/мин мл Удельная амнлолнтическая активность„ Е/мин. мг белка культуральной жидкости Количество антибиотика в культуральной жидкости, мкг/мл Продуктивность культуры, мкг антибиотика/мг биомассы форд. Отбор проб суспензии (по 7 мл) сразу после посева и через 24 ч культивирования (хранить в холодильнике).
Занятие 3. Отбор проб культуры через 48 ч роста. Определение в культуральной жидкости (пробы О, 24 и 48 ч) белка по Бредфорд; протеазной и амилазной активности. Определение количества биомассы (по оптической плотности, пробы О, 24 и 48 ч). Отбор проб кудьтуры через 72, 96 н 120 ч роси.
Подготовка мембранных фильтров зцш построения калибровочной кривой. Занятие 4. Определение в культуральной жидкости (пробы 72, 96 и 120 ч) белка по Бредфорд, протеазной и амилазной активности. Определение количества биомассы (по оптической плотности, пробы 72, 96 н 120 ч).
Построение калибровочной кривой для определения биомассы бактерий. Занятие 5. Определение антибиотнческой активности культуральной жидкости (пробы 72, 96, 120 ч). Занятие б. Расчеты, оформление результатов, зачет. ЗАДАЧА 2. РЕГУЛЯЦИЯ СИНТЕЗА ТРИПТОФАНАЗЫ ЕЗСНЕЯ!СН(А СОП Регуляция метаболизма позволяет управлять скоростью биохимических процессов в клетке и служит важнейшим механизмом приспособления микроор- * Задача разработана сатрудин клмн кафедры микробиологии биологического факультета МГУ М.Н. Пименоаой н Н.Н.Гречушкнной; приводится здесь в псрсрабатапном в сокращенном варианте. Впервые текст задачи опубликован я кнз Избранные задачи большого практикума пе микробиологии.
— Мз Изд-во МГУ, !985. 343 ганизмов к окружающей среде. Регуляция может осуществляться на уровне синтеза и активности ферментов. Основными механизмами регуляции синтеза ферментов являются ицлукция и репрессия. Болыцое значение имеет так называемая катаболитная репрессия, при которой синтез ферме!па, разлагающего субстрат, подавляется при использовании клетками альтернативного, более выгодного источника энергии (чаще всего, глюкозы). Примером фермента, синтез которого регулируется путем катаболитной репрессии, является триптофаназа (НФ.4.1.99.1., Е-триптофаниндоллиаза дезаминирующая)*, катализирующая реакцию разложения триптофана: А-триптофан + Н70 — у индол + пируват + 14Нв гзЫЬйпбОЛГЬЬ' ОПрЕдЕЛИтЬ ВЛИЯНИЕ ППОКОЗЫ На СИНТЕЗ трннтОфаиаЗЫ ЕГС/ГЕГГСйа СОй'.
Ход выполнения задачи Микроорганизм и его культивирование. В качестве объекта исследования используют штамм Е.со/г' 85 из коллекции культур кафедры микробиологии МГУ. Полученную из музея культуру Е.со/г' пересевают в пробирки со скошенным МПА и выращивают 1 — 2 сут при 30 "С. Затем петлю такой культуры переносят в ! 00 мл основной среды следующего состава (г/л): гидролизат казвина — 5,0; КН7РО4 — 1,0„'КгНРОв — 1,0; ГчаС! — 1,0! М8804'7НгΠ— 0,7; (1 ~Н4)гЯОв — 4,0," нитрат натрия — 0,5; вода дистиллированная.
Исходное значение рН среды 6,7 — 7,0. Среду готовят в качалочных колбах на 750 мл и стерилизуют при 1 ати. Культуру выращивают в стационарных условиях при 30 С в течение 18 — 24 ч и используют затем в качестве инокулята опытных сред. Прн постановке опыта для культивирования Е. сой используют два варианта среды: 1) основную среф; 2) среду с глюкозой (2,0 г /100 мл основной среды). Основную среду разливают по 200 мл в качалочные колбы и стерилизуют при 1 ати. Раствор глюкозы готовят отдельно и вносят в основную среду перед ес засевом. Для этого навеску глюкозы вносят в мерный цилиндр и доводят объем до 10 мл дистиллированной водой, затем полученный раствор глюкозы переливают в пробирку и стерилизуют при 0,5 ати. Отдельно в пробирке стерилизуют 10 мл дистиллированной воды, которую вносят затем в среду 1.
Посевной материал вносят в количестве 2% (по объему). Засеянные колбы помещают на качалку (200 — 300 об/мин). Культивирование проводят при 30 'С в течение 18 — 24 ч. Приготовление суспензии клеток. Из каждого варианта культуры отбирают 80— 100 мл и центрифугируют при 5 — 6 тыс. К в течение 10 — 15 мин. Клетки отмывакут водой или физиологическим раствором (0,85 % !ЧаС1) и суспендируют в 1 мл воды. Из каждой суспензии отбирают 0,1 мл для определения белка.
Оставшуюся часть суспензии используют для определения активности триптофаназы. Определение активности триптофаназы. Для проведения реакции к суспензия клеток в фосфатном буфере (реакционной смеси) добавляют Е-триптофан и ннкубнруют определенное время при 37 С. Об активности тригпофаназы судят по количеству индо- * Подробны сма Г/агг я ег аг, Ыесьап!впг оГ сагвьоиве гергеввюп оГ ггургорьапвве вупгбевв 1п ЕгаугепсГгга сан // Ы!сгоЬго1оау. — 1994. — и ! 40. — Р. 2125 — 2134; Кадая К.
К, УапоЯу С. Иеап!аг!оп оГ гье Гса!гепсlиа сагвпа орегогс пввсепг 1евг1ег рергме сап!го! вг 1!ге огас егор сосед // Я.васгег!о!., 1997. — У. 179. — Р. 1774 — 1779. ла, образованного клетками за время реакции. В качестве контроля используют суспензию клеток без триптофана. При расчете активности фермента учитывают содержание в суспензии клеток белка. Реакционные смеси готовят в пробирках с притертыми пробками.
Для каждого варианта используют 6 пробирок (3 контрольных и 3 опытных). В каждую пробирку вносят 0,2 мл 0,2 М )Ча-фосфатного буфера (рН 7,8); 0,1 лат суспензии клеток и 1,6 мл дистиллированной воды. Смеси тщательно перемешивают и помещают пробирки в ультратермостат на 37 С. Через 1О мин в опытные варианты вносят по 0,1 мл раствора триптофана (10 мг/мл). Через 1, 20 и 60 мин пробирки вынимают из ультратермостата и останавливают реакцию, добавляя к реакционной смеси 0,2 мл свежеприготовленного распюра трихлоруксусной (ТХУ) кислоты. После этого в реакционной смеси определяют количество индола. Определение иидола Индол экстрагируют из смеси толуолом и определяют колориметрически с реактивом Эрлиха.
Для этого в пробирки с реакционной смесью добавляют по 2 мл толуола и перемешивают содержимое пробирки, вращая пробирки между ладонями. (Внимание! Работа с толуолом яуоводится лад тягой7) Встряхивать пробирки не следует, так как образуется эмульсия, которая не расслаивается. После расслоения жидкости в пробирках отбирают сухой пипеткой 0,5 мл раствора индола в толуоле (верхний слой) и переносят его в сухую пробирку с притертой пробкой. Добавляют 1 мл реактива Эрлиха и 4,5 мл кислого спирта, тщательно перемешивают. Окраска развивается в течение 15 мин. Оптическую плотность раствором измеряют на ФЭКе или спектрофотометре при 540 нм в кювете с рабочим расстоянием 1 см.
Измерение ведут против воды. Количество индола (мкг) пересчитывают по калибровочной кривой и вносят в табл. 29.3. Для построения калибровочной кривой вместо реакционной смеси используют растворы, содержащие в 2 мл от 10 до100 мгк индола. Для этого вначале готовят стандартный раствор с конпентрацией индола 50 мкг/мл, а зпем делают ряд разведений (табл. 29.4). К полученным разведениям добаш~яют толуол и проводят определение индола, как описано вьш|е. Необходимые для анализа реактивы готовят следующим образом.
Для приготовления реактива Эрлиха 5 г л-диметиламинобензальдегида растворяют в 100 мл 96%-го этилового спирта. Для приготовления кислого спирта к 92 мл 96%-го этилового спирта добавляют 8 мл концентрированной НС1. Определение белка. Определение белка в суспензии клеток осуществляют методом Лоури. Метод основан на биуретовой реакции пептидной связи и реакции на циклические аминокислоты тирозин и триптофан.
Чувствительность — 20 — 150 мкг белка в 1 мл раствора. Метод применим только для растворимого в воде белка, поэтому клетки бактерий предварительно гидролизуют. Таблица 293 Определение ицдала в реакции триптофяиазы 345 Таблица 294 Принповлеиие растворов иидола для построения калибровочной кривой и их гппическая гглотиость Для проведения ггшролиза 0,1 мл пцательно перемешанной суспензия клеток и 2,9 мл 2 н. )чаОН помешают в пробирку, закрывают ее резиновой пробкой и выдерживают 2 ч при 37'С. После гидролнза к смеси добавляют 3 мл НзО.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
