А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 98
Текст из файла (страница 98)
В каждом варианте ставят контроли, в которые не вносят энергетический субстрат. После инкубации во все варианты вносят меченые субстраты: иС-метанол и нС- СО, — в гетеротрофные вариант.ы, метанол и иС-СОт — в метилотрофные варианты, '|С-СО, — в автотрофные варианты. Отбирают пробы в двух повторностях через каждые 30 мин в течение 2 ч инкубации (всего 5 точек, включая начальную). Пробы быстро фильтруют под тягой через ультрафильтры и активность на фильтрах просчитывают в сцинцнлляционном счетчике (подробно процедура описана а гл.
27). Целесообразно, чтобы один и тот же студент отбирал пробы из одного или двух вариантов опыта. Оформление результатов. Результаты оформляют в виде графиков нарастания радиоактивности, включившейся в клетки, осажденные на ультрафильтрах. Студенты обмениваются полученными графиками, с тем чтобы каждый студент имел графики фиксации углекислоты и метанола во всех вариантах опыта. Делают заключение об изменении способности клеток к фиксации углекислоты и/или метанола в зависимости от способа выращивания культур. Обсуждают возможные варианты развития клеток Р. дел1гг(7)сале в природных экологических нишах или тех или иных консорциумах микроорганизмов. Материалы, пборудавааае, посуда, реактивы Орбитальная термостатированная качалка на 37 'С, колбы на 250 мл для вариантов культуры — 4; бутыли на 1 л с герметичными резиновыми пробками — 4; шприцы для отбора проб — 20; установка для ультрафильтрацин — 1; реактивы для приготовления сред, рН-метр, ФЭК„центрифуга, меченные по углероду иС-метанол и иС-СО2 План выполнения задачи На проведение залачи необходимо 24 ч.
Занятие 1. Подготовка сред и посуды к стерилизации. Выращивание посевного материала Р. деатлу)саад Занятие 2 Засев клеток в опытные среды, отбор проб при посеве и определение оптической плотности культур, расчет вариантов постановки опыта и количеств вносимых меченых СО, и метанола в различные варианты. Занятие 3. Постановка экспериментов, отбор проб, определение динамики фиксации меченых субстратов. Занятие 4. Расчет количества фиксированных субстратов в разных вариантах опыта.
Построение кривых фиксация уперела клетками из разных вариантов. Написание отчета. Глава 27 АССИМИЛЯЦИЯ УГЛЕКИСЛОТЫ ЦИАНОБАКТЕРИЯМИ Цианобактерии — широко распространенная группа оксигенных фототрофных микроорганизмов. Подавляющее большинство цианобактерий растет в фотоавтотрофных условиях, ассимилируя углекислоту. 333 ЗАДАЧА. ФИКСАЦИЯ УГЛЕКИСЛОТЫ ЦИАНОБАКТЕРИЯМИ ггв~лМаююг ~ и ю и р ~ ю ии б «- териями углекислоты по включению в клетки радиоакгивного углерода из )ЧаНг4СОз. Ход выполнения задачи Микроорганизмы и их культивирование.
Используют одноклеточные или нитчатые цианобактерии из родов Яупесйососсггз, Яупесйосуз|и, Р!есгопелга и др. Культуру цианобактерий выращивают на среде ВО-11н или Кратца-Майерса (состав сред см. в приложении 4). Среду разливают в колбы на 750 мл по 300 мл и стерилизуют при 1 ати. После стерилизации доводят значение рН до 7,5 — 8,0, используя стерильный 5%-й раствор )хаНСОг. В качестве посевного материала используют 4 — 5-суточную культуру цианобактерий, выросшую на среде того же состава. Посевной материал вносят в количестве 5 — 10% (по обьему).
Культивирование ведут в люминостате (3000 лк) при 25 — 28 С в течение 4 — 6 сут. Подготовка еуепеизии клеток. Для посгановки опыта клетки из выросших культур осаждают центрифугированием (3000 я, 15 мин), отмывают и суспендируют в свежей опьпной среде, содержащей гггрис- или Ха-фосфатный буфер (рН 8,0, конечная концентрация 1 мМ) и 1чаНСО, в качестве носителя (в концентрации 1 мМ). Суспензию разводят опытной средой до оптической плотности 0,5 (длина оптического пути 1 см, г. = 750 нм) и разливают по 10 мл в две колбы Эрленмейера на 50 мл.
Одну колбу помещают в люминостат (3000 лк), а другую выдерживают в темноте. Проведение эксперимента. Через 10 — 15 мин после начала инкубации в каждую колбу вносят 100 мкл )чаНг4СОг (конечная концентрация — 104 Бк/мл) и немедленно отбирают автоматической пипеткой (1,0 мл) начальнукг пробу (в двух повторностях). Последукяцие пробы того же объема отбирают в двух повторностях через 30, 60 и 90 мин после внесения меченого бикарбоната.
Отбор проб производят под тягой. Пробы немедленно осаждают на мембранных фильтрах («Сынпор», )чб) и промывают двумя порциями слегка подкисленной воды (рН 5) для удаления углекислоты, которая не успела фиксироваться клетками. Пробы фильтруют на фильтровальной установке, подключенной к водоструйному насосу.
Затем фильтры высушивают на воздухе (под тягой или при подогреве лампой накаливания). Сухие фильтры помещают в сцинтилляционные флаконы (биомассой вверх), наливают по 5 мл сцинтилляционной жидкости ЖС-106 и плотно закрывают пробками (работа проводится под тягой, сцинтилляционная жидкость отбирается с помощью дозатора). Радиоактивность клеток на фильтрах просчитывают на спинтилляционном счетчике в течение 1 мин. Оформление результатов.
Результаты эксперимента представлшот в виде ленты с цифрами радиоактивности„а также в виде графика фиксации цианобактериями углекислоты (в импульсах в минуту, срггг) на свету и в темноте с течением времени. Делают заключение о светозависимом характере ассимиляции цианобактериями углекислоты. 334 Материалы, оборудование, посуда, реактивы Люминостат; люксметр; водосгруйный насос; ФЭК или спектрофотометр; мембранные фильтрьй пипетки автоматические на 1 мл и 100 мкл; колбы на 750 мл; колбы Эрленмейера на 50 мл — 21 пипетки на 1 — 2 и 5 мл — по 3; соли для приготовления среды; 1ЧаН>4СО>; сциитилляциоиная жидкость ЖС-106.
Плаи проведеиия задачи Дяя проведения задачи требуется 6 — 8 ч. Занятие 1. Приготовление и стерилизация среды. Занятие 2. Посев цианобактерий. Занятие 3. Приготовление суспеизии клеток, проведение эксперимента по фиксации 1ЧаН4СО>. Занятие 4. Измерение радиоактивности фильтров (проаодится оператором). Оформление резул ьтатов. Глава 28 ТРАНСПОРТ СУБСТРАТОВ В КЛЕТКИ МИКРООРГАНИЗМОВ Многие питательные вещества поступают в клетки путем праспюй, или облегченной, диффузии. Однако для многих быстрорастущих организмов такой механизм поступления веществ в клетку оказывается неприемлемым вследствие низкой скорости поступления субстрата.
Многие микроорганизмы выработали специальные механизмы активного транс»ар>иа веществ в клетку, который позволяет накапливать субстрат роста против градиента концентрации„таким образом создавая внутриклеточные концентрации вешеств гораздо более высокие по сравнению с окружающей клетки средой. К системам активного транспорта относятся симпарт, унипарт, антипарт и перенос групп — все они зависят от энергии и считаются системами вторичного транспорта. К первичному транспорту относят создание трансмембранного градиента протонов за счет протекания реакций химического окисления веществ или фотосинтетических процессов. Изучение транспортных процессов проводят на чистых культурах микроорганизмов, взятых из середины или конца экспоненциальной фазы роста, отмывая клетки соответствующей средой или буфером и инкубируя их с меченными по углероду или азоту субстратами транспорта.
Хорошо изучена система транспорта иона аммония, для исследования которой часто использовали неметаболизируемый обычными клетками >4С-метиламин — структурный аналог иона аммония. Однако имеется целый ряд микроорганизмов — метилотрофов, которые активно метаболизируют метиламин, используя его в качестве источника углерода и энергии, а часто и азота. Имеется, в частности, метилотрофная бактерия Ме>1>у1а1>ас>Пиг Па8ейа1иг КТ, которая использует для роста всего лигиь два субстрата — метанол и метиламин, являясь облигатным организмом. Клетки М Яа8ейауиг способны расти на средах с метанолом и аммонием (источники С и 1х), с метанолом (С) и метила- мином (б1), с метиламином (С) и аммонием (Х) и метиламином (С и Н).
Во всех случаях клетки формируют разные в кинетическом отношении транспорт- 335 ные системы для метиламина и метанола, отличающиеся по скорости процес- са и К, для соответствующего субстрата. ЗАДАЧА. ИЗУЧЕНИЕ ТРАНСПОРТНЫХ СИСТЕМ ОБЛИГАТНОГО МЕТИЛОТРОФА )г!ЕТНУ! ОВАСИ.!Л)В ЕЕАОЕ! ! АТЬ КТ аа»л~аи»:а ~ р р» р иС-метанола и '"С-метиламина в клетки М. 7)а8е!!ада КТ и выявить энергозависимость транспортных процессов для этих субстратов в клетки организма.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
