А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 99
Текст из файла (страница 99)
Ход выполнения задачи Выращивание культуры и подготовка клеток для экспериментов Бактерии культивируют в жидкой минеральной среде ММБ (см. прил. 4) с метанолом (150 мМ) или метиламином (40 мМ) в качестве источников углерода и энергии. Клетки выращивают в нескольких вариантах: Вариант 1: метанол (150 мМ) и метиламин (10 мМ) без аммония. Вариант уд метанол (150 мМ) с аммонием в составе среды. Вариант бй метиламин (40 мМ) без аммония. Культивирование проводят на орбитальной качалке при 45 'С в течение суток (до достижения Аа е -0,8 — 0,9).
Клетки центрифугируют (6 тыс. я, 15 мин, 4 С), отмывают три раза холодной средой МЯ. (без источника углерода) и суспендируют в холодной среде МЯ до плотности 0,05 — 0,1 мг сух. массы клеток/мл. Колбы с суспензиями помещают на качалку при 45 С на 30 — 40 мин для снижения эндогенного дыхания. Проведение эксперимента. По 10 мл суспензии клеток из каждого варианта помещают в термостатируемую ячейку (45 С) на магнитную мешалку и после установления нужной температуры добавляют "С-метанол или "С-метиламин до конечной концентрации 1 — 5 мМ.
Специфическую радиоактивность субстратов подбирак~т на уровне 0,1 — 0,2 мкКи/ммоль. Из суспензий отбирают пробы с интервалом в 1 мин и немедленно осаждак>т клетки на мембранных фильтрах (»Влздипор», РФ; 0,45 мкм). Клетки на фильтре отмывают 10 мл 50 мМ К-фосфатного буфера (рН 7,4) при 20'С и высушивают при 100 С в сушильном шкафу в течение 10 мин. Радиоактивность просчитывают в сцинцилляционном счетчике Магк-2 ()Чис1еаг С!Всайо, США) после помещения фильтров (биомассой вверх!) в сцинцилляционные стаканы и добавления 5 мл сцинцилляционной жидкости )КС-105 в каждый. Пробы отбирают в течение 10 мин и строят кривые нарастания радиоактивности в клетках метилотрофов (включение метки от субстратов). Изучение влияния ингибиторов транспорта. В параллельных экспериментах изучают влияние ингибиторов дыхания и разобщителей на скорость транспорта веществ.
Эксперимент начинают, как в опыте 28.2, однако после 5 мин инкубации добавляют цианид (10 М, конечная концентрация), азид (10 М) или СССР (сагЬопу1 суапк!е-3-сЬ!огор11епу1Ьуг)гахопе, 10 М). Пробы продолжают отбирать с интервалами 1 мин. Строят графики транспорта веществ и сравнивая>т их с графиками незаингибированного процесса. 336 Обработка результатов.
Строят ~рафики транспорта субстратов в клетки, вьгращенных в разных условиях, и сравнивают (рассчитывают) скорость транспорта для каждого случая. Делают заключение о влиянии условий выршцивания клеток на скорость и специфичность транспортных процессов для метанола и метиламина.
Делают выводы о влиянии ингибиторов на транспорт веществ у метилотрофов. Материалы, оборудование, посуда, реактивы Колбы для орбитальной качалки — 20; орбитальная качалка; ультратермостат; автоматические пипетки для отбора проб с носиками; фильтры с насадками лля отбора проб; буфер К-фосфатный (50 мМ, рН 7,2); среда В (см. приложение 4) для выращивания бактерий; метанол; метиламин; '4С вЂ” метанол и метиламин; сушильный шкаф иа 100 'С; фильтровальная бумага. План выполвеияя задачи Для прогедения залачи необходимо 18 — 20 ч (3 занятия). Занятие 1. Посев микроорганизмов, подготовка сред и буферов лля отбора проб, расчет количества меченых субстратов и ингибиторов, Занятие 2. Центрифугированис культуры, подготовка клсток, постановка эксперимента, подсчет результатов. Занятие 3.
Обработка результатов, построение графиков, расчет скорости транспорта субстрата в клетки. Глава 29 ОБРАЗОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМАМИ ФЕРМЕНТОВ И МЕТОДЫ ИХ УЧЕТА ЗАДАЧА 1. ОБРАЗОВАНИЕ ВНЕКПЕТОЧНЫХ ФЕРМЕНТОВ И АНТИБИОТИКОВ Микроорганизмы могут быть источником получения разных ферментов, имеющих важное значение для научных биологических исследований, медицины, сельского хозяйства, пишевой, легкой и других отраслей промышленности. Благодаря простоте культивирования, высокой скорости роста, возможности получения сверхпродуцентов путем селекции и применения генетических методов микроорганизмы более перспективны как источники ферментов по сравнению с растениями и животными.
Кроме того, отдельные микроорганизмы образуют ферменты, которые ни растения, ни животные не синтезируют. К числу продуцентов практически важных ферментов относится ряд мицелиальных грибов, дрожжей и бактерий. Ферменты микроорганизмов, которые уже получают промышленным путем„являются главным образом внеклеточными, т.е. ферментами, локализованными с внешней стороны клеточной мембраны.
Преимущество получения внеклеточных ферментов (экзоферментов) состоит в легкости отделения от среды и очистки. Это делает их про- 337 изводство более дешевым, чем получение эндоферментов. Функция большинства экзоферментов заюлочается в расщеплении высокомолекулярных субстратов с превращением их в форму, в которой они могут поглощаться клетками микроорганизмов. В качестве экзоферментов микроорганизмы чаще всего образуют гилролазы: протеазы (протеиназы и пептидазы), амилазы, декстраназы, целлюлазы и ряд других. Помнл1о ферментов многие микроорганизмы синтезируют антибиотики. и,~дб~~ды: ~рп р у, у б~ у активность в культурах Ягергатусег/)айае при росте на средах разного состава.
Ход выполнения задачи Микроорганизмы и нх культивирование. В работе используют стрептомицет Югер!отусее /гайае (штамм У(е 25 из коллекции кафедры микробиологии МГУ). Этот штамм образует комплекс экзоферментов, который включает по крайней мере пять протеиназ, две пептидазы и а-амилазу. Образование отдельных экзоферментов о./гайае зависит от условий роста этой бактерии. о. /гайае помимо экзоферментов выделяет в культуральную жидкость антибиотик тилозии, который активен против грамположительных и некоторых грамотрицательных бактерий, и применяется в животноводстве. Культуру Б.
~айае поддерживают на твердой среде следующего состава (г/л): кукурузный экстракт — 10,0; крахмал растворимый — 10,0; ()ЧН,)зВО4 — 3,0; 1ЧаС1 — 3,0; СаСОз — 2,0; агар — 20,0; вода водопроводная — до 1 л. Навеску крахмала растворяют отдельно в небольшом объеме водопроводной воды при слабом нагревании и вносят в общий объем среды. Начальное значение рН доводят до 7,5 — 8,0 с помощью 1 н. 1чаОН и затем вносят навеску агара.
Колбу с готовой средой ставит на кипящую водяную баню. После того как агар расплавится и среда станет гомогенной, ее разливают в пробирки (по 1/3 их обьема) и стерилизуют в автоклаве при 1,0 ати. Культуру о. /Уайае выращивают на скошенном аккре в течение 5 сут в термостате при 30 С и хранят в холодильнике при 4'С. Для получения посевного материала используют лсидк)ло среду следующего состава (г/л): кукурузный экстракт — 10,0; крахмал растворимый — 15,0; КН~РО4— 0,45; (14Н4)з504 — 0,5; )4аС1 — 2,0; Уп$04 — 0,02; Мя504 — 0,9; СаСОз — 5,0; вода водопроводная — до 1 л. Крахмал до внесения в среду готовят, как описано выше.
Начальное значение рН среды доводят до 7,5 — 3,0 с помошьк! 1 н. ХаОН, после чего разливают по 100 мл в качалочные колбы объемом 750 мл, закрывают их ватными пробками и стерилизуют в автоклаве при 1 ати. Посев проводят изогнутой под прямым углом бактериологической иглой (крючком), перенося стрептомипет из пробирки (хранящейся в холодильнике) вместе с блочком твердой среды в колбу с жидкой средой.
Колбы помещают на качалку (200 об/мип) и выращивают культуру при 30'С в течение 3 сут. Выросший посевной материал вносят в разные варианты опытной среды (см. ниже). В качестве посевного материала можно также использовать споры о./гайае, полученные выращиванием стрептомицета в пробирках на твердой питательной среде в течение 5 сут. Споры смывают с поверхности питательной среды в пробирке стерильной водопроводной водой или жидкой питательной средой (3 — 5 мл), используемой для получения посевного материала, и вносят в опытные варианты питательных сред. 338 Для опыта используют среду следующего состава (г/л): кукурузный экстракт— 10,0; крахмал растворимый — 15,0; КНтРО, — 0,45; (НН4)2804 — 0,5; НаС1— 2,0; Хп804 — 0,02; М8804 — 0,9; СаСОЗ вЂ” 5,0.
К основной среде (контроль) добавляют один из следующих субстратов (г/л): глюкоза — 10,0; соевая мука— !0,0; роговая мука — 5,0; рыбная мука — 5,0„фибрин — 5,0; шерсть — 5,0 (шерсть измельчают бритвой на мелкие фрагменты длиной около 1 мм); вода водопроводная — до 1 л.
Крахмал до внесения в среду готовят, как описано выше. Начальное значение рН среды доводят до 7,5 — 8,0 с помощью 1 н. НаОН. Затем среду разливают по 100 мл в качалочные колбы объемом 750 мл, закрывают их ватными пробками и стерилизуют в автоклаве при 1,0 ати. При приготовлении среды с глюкозой этот субстрат стерилизуют отдельно в виде 50%-го водного раствора в автоклаве при 0,5 ати и добавляют к стерильной среде перед посевом в количестве 2 мл на 100 мл среды. Каждый студент использует в работе колбу с одним вариантом опытной среды (т.е.
с глюкозой, соевой, роговой, рыбной, мукой фибрином или шерстью) и в качестве контроля — вторую колбу с основной средой, не содержащей ни один из перечисленных субстратов. В колбы с опытной и основной средой вносят посевной материал, полученный на жидкой (5% по объему) илн твердой питательной среде (1 % по объему) После посева колбы помещают на качалку (200 об/мин) и выращивают культуры при 30 С в течение 4 сут. В качестве тест-культуры при определении образования антибиотика тилозина Х /гаг!!ае используют культуру Вас!!!кк тиЫ!и, штамм Хо бб33, из коллекции кафедры микробиологии МГУ. В. зиМ!й выращивают на 2%-м МПА, рН 7,0— 7,2, смывают со скошенного агара дистиллированной водой и стерильно засевают данной суспензией клеток матрасы с 2%-м МПА.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
