А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 95
Текст из файла (страница 95)
Раствор применяют после осветления. Ход опрвдслеиия. К 1 мл образца в 25-миллилитровой мерной колбе прибавляют 0,2 мл 50%-го раствора сегнстовой соли, 10 мл воды, 2 мл реактива Нссслсра, доводят до метки и псрсмешивают. Через 10 мин колоримстрируют; светоФильтр фиолетовый, Х = 400 — 425 нм, кювета 1 см. Концснтрацик> ХН', (мкг/мл) опредсл>пот гю Формуле Сю„= С 25/К где С вЂ” концентрация !4Нл(мкг/мл), определенная по калибровочной кривой, составленной на основе концентраций !4НлС1 от 10 до 50 мкг/мл ННл; !' — объем пробы, взятой лля анализа, мл; 25 — объем пробы, мл. ОФормление результатов. На основании изучении динамики содержания соединений азота в среде культивируемых бактерий в совокупности с данными об автотрофности нитриц>икаторов (что следует из состава сред, в которых отсутствуют источники органического углерода) делается вывод об участии этих соединений в процессах получения энергии и восстановительных эквивалентов.
ФЭК-5бМ; центрифуги настольные; потснциомстр рН 121; нитратный ион-сслсктивный электрод; фарфоровые чашки для выпаривания — 5; водяные бани, снабженные крышкой с отвсрспшми для фарфоровых чашек; обратный холодильник— 1; мерные колбы на !00 мл — 5; стсюлянные палочки — 5; колбы качшючныс на 750 мл — 3; пипетки стерильные на 1О мл — !3; колба на 500 мл — 1; мсрныс колбы на 50 мл — 7; пипетки на 1 мл — 5; колбы на 250 мл — 2; цилиндр на 250 мл — 1; цилиндр на 50 мл — 1; реактивы для приготовления сред и проведения анализов.
Т а б л и ц а 24.4 Образование нитратов и иитритов иитрификаторами План выполнения задачи Содержание в исследуемых образцах, мкг/мл Исследуемые образцы >чг>7 * Не определять. 324 Культуральная жидкость: /уйгалвп>опал Зр. Н!п>валр!> а 5р. Контроль для нитрификаторов: 1 фазы П л)азы Культуральная жидкость: !у!г> обаслег нчполга~Ысу>' Материалы, вбпрудввапие, посуда, реактивы Для выполнения задачи необходимо 18 — 20 ч.
Занятие 1. Приготовление и стерилизация сред, добавок и посуды. Поссв бактерий в культуральныс среды. Занятие 2. Построение калибровочных кривых для опрсдслсния >чО>, )чО>, )з(Нл. Морфологичсское изучение клеток посевной культуры с использованном фазовоконтрастной микроскопии. Занятия 3, 4, 5. (Опыты повторяют, чтобы получить прсдставленис о динамике процесса нитрификации.) Отдслснис культуральной жидкости от клеток центрифугированисм. Определение в культу- ральной жидкости числа клеток и содержания !чО>, )чО,, >'лНл Оформление результатов.
ЗАДАЧА 3. ОКИСЛЕНИЕ СОЕДИНЕНИЙ ЖЕЛЕЗА ЖЕЛЕЗОБАКТЕРИЯМИ В некоторых водоемах с пресной водой, где в высоких концентрациях содержатся восстановленные формы железа, железобактерии образуют природные колонии, покрытые коркой окиси железа. Биологическое значение окисления железа различно для разных организмов. Ас!П!гйуобас!!!ил 1еггохЫапх (по традиции и из таксономических соображений отнесенный к тионовым бактериям) облаласт типичным литоавтотрофным обменом, окисляя двухвалентное железо в трехвалентное через цитохром с и цитохромоксидазу. Образующийся при этом АТФ служит для автотрофной фиксации углекислоты.
А. 7еггох!Палл способен окислить пирит (ГеБ,) с образованием трехвалентного железа и серной кислоты. Развиваясь в кислой среде !рН ),4 — 6,0), где в растворе устойчив не только Ре~', но и Ре~', организм не образует оформленных отложений железа, но при этом идет реакция 4Ге" ь 4Н" + О, -» 4Ге" + 2НзО К собственно железобактсриям относят организмы, образующие оформленные осадки железа.
Типичными представителями железобактерий являются нитчатые, заключенные в чехол бактерии группы орЬаегоП1из !у мне~их нз них чехол инкрустирован окисью железа), а также представители родов !.ергойг1х, Тсхо11тх, 5Ыегесоссиг. Их легко выращивать в средах, содержащих органические вещества и Рс '. Такие организмы накапливают в чехлах окись железа, но его значение для физиологии этих бактерий и их способность развиваться как хемоавтотрофы не доказана.
Более очевидной представляется способность к хемоавтотрофному росту для другой, имеющей характерную структуру железобактерии — СиПЫпеПа. Она растет на минеральной среде, содержащей в качестве минерального источника восстановленного железа осадок сульфида железа. Использование фактически нерастворимой соли железа сводит к минимуму трудности, связанные со спонтанным окислением железа при рН около 7,0. В этих культурах СаП1оледп образует на стенках сосуда хлопьевидные колонии.
Они состоят в основном из окисла железа, а маленькие бобовидные клетки данной бактерии располагаются на разветвленных кончиках п!юпитан ныл гилроокнсью железа стебельков, Са1Попе1!а напоминает ПЫегососсиз, чрезвычайно мелкий организм, едва отличимый от частиц железистого осадка. Электронно-микроскопические снимки показывают, что мелкие клетки ХЫегососсиз несут нитевидный придаток, напоминающий отдельное волокно из «стебелька» СадфлеПа. Клетки Яс1егососсах обьединяются по 8 — !О в подвижную колонию, которая активно плавает над поверхностью дна, хотя жгутиков не было найдено. В зоне развития клеток встречается обычно большое количество осадков железа, но сами клетки остаются свободными.
Хергойнх осЬ«асеа — наиболее широко распространенная железобактерия, которая образует обильные скопления окислов железа ржавого цвета в медленно текущих ручьях, на болотах, на выходе железистых источников. Несмотря на признанное участие в образовании болотных железных руд, относительно !.. осЬгпсеа до сих пор нет твердой уверенности, что это самостоятельный организм, а не форма роста другой бактерии, например Яр!юегоПП1из.
7.ергогллх образует тонкие железистые трубки, представляющие собой влагалиц!а„ которые всегда бывают гладкими, неветвяшимися, иногда слегка волнистыми и на всем своем протяжении сохраняют строго одинаковый диаметр (внутренний — порядка 1 мкм, внешний — порядка 2 — 3 мкм). Поверхность влагалища имеет тонкую сетчатую структуру из косо расположенных нитей, которую иногла удается наблюдать и прн 325 помощи светового микроскопа. Влагалшце А. асйтгасеа, полобно таковому у бактерий группы арЛаегогтуиз, образовано цепочкой цилиндрических клеток, которые облалают склонностью выскальзывать из него, поэтому только на одном конце трубки можно найти живой организм, вся остальная часть представляет собой покинутое влагалище.
Клетки А. осЬгасеа напоминают клетки 5рйаегаттуат. В них также наблюдаются капли липилиых включений, освободившиеся клетки подвижны благодаря наличию жгутиков. Бактерии группы Тохойгтх встречаются сравнительно репко в холодных железистых источниках„образуя отдельные железистые нити, нс переплетенные между собой. Возможно, что ожелсзнению полвергается выделяемая при лвижснии «леток слизь.
атттарц: б: ри ц б пвухвалентного железа в трехвалентное и количественная оценка этого процесса. Ход выпопнения задачи Микроорганизмы и их культивирование. Используют культуры Т.ер!аг!тпх зр. и Аси тг)г!аЬастоиз/еггахтт!апз (окнсляющие как соединения железа, так и соединения серы).
Т,ерша!!тлх зр. выращивают в среде следующего состава (г/л): понтон — 4,0; глюкоза — 3,0; МКБ04 — 0,1; СаС!т — 0,05; МпВОч — 0,01; ГеС!з 0,001; ттламин — 0,2 мг; биотин — 0,02 мг; (!ЧН4)лГе-лимоннокисльтй (закисная соль)— 0„25; вода водопровопная — до 1 л. рН среды до стерилизации устанавливают 7,0 с помощью 10%-х растворов !ЧаОН и НлБ04. А./еггахЫапе культивируют в среде следующего состава (г/л): 1. (!ЧНт)лЯ΄— 3,0; К,НР04 — 0,5; КС! — 0,1; МяБ04.7Н,Π— 0,5; Са(!ЧОз)т — 0,01; вода дистиллированная — по 700 мл.
П. ГеБ04. 2НлΠ— 44,2; 1 мл 10 н. Н,304, вода диспплированная — до 300 мл. Растворы 1 и Н стерилизуктт отдельно при 0,5 ати 30 мин. Перед посевом растворы сливают, стерильно доводят рН до 2,5 с помощью !0%-х Нл$04 или )ЧаНСОз. Срецу разливают по 100 мл в стерилъные качалочные колбы. В качестве посевного материала служат культуры в конце экспоненциальной фазы роста (3-суточные). Их вносят в количестве 10% (по объему). Выращивание культур ведут на качалках при температуре 28 — 30 'С в течение недели.
Ежедневно отбирают пробы для микроскопирования клеток и определения количества окисного железа. Мвкроскопировавие. Для наблюдения за образованием железистых чехлов Х,ертатйтт тх зр. готовят фиксированный препарат клеток, погружают его на 3 — 5 мин в 5%-й раствор желтой кровяной соли, затем без промывания — в 0,1 М раствор НС!. Осадок трехвалентного железа синеет, что видно при микроскопировании препарата. Чтобы опревелить количество клеток А./еггохЫаае, готовят фиксированные препараты и подсчет ведут по методу Виноградского.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
