А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 103
Текст из файла (страница 103)
Затем раствор КС! сливают дскантацией в цилиндр с пеиммобилизованными клетками. Последние порции жидкости над гранулами аккуратно отбирают пипеткой. Гранулы с клетками промывают два раза 2%-м раствором КС! и один раз 0,1 М К-фосфаттпям буфером. Для этого в цилиндр с гранулами вносят по 20— 25 мл соответствующего раствора, осторожно перемешивают стеклянной палочкой, отстаивают 5 — 10 мин и сливают раствор в цилиндр с неиммобилизованными клетками. Общий объем промывных вод не должен превышать 100 мл. В промывных водах определяют белок неиммобилизованных клеток (см. ниже). Проведение реакции. К смеси гранул в К-фосфатном буфере добавляют равньгй объем 1 М фумарата аммония, тщательно перемешивают, отбирают пипеткой с широким носиком 10 мл и переносят в реакционную колбу на 50 мл.
Добавляют 0,1 мл толуола, закрывают ватной пробкой и колбу помещают на качалку (на 2 или 3 ч при 37 или 30'С соответственно). Оставшуюся часть суспензии гранул сразу отфильтровывают через бумажный фильтр в сухую химически чистую пробирку или центрифугируют (3 — 4 тыс. я, 10 — 15 мин). В фильтрате (супернатанте) определяют количество фумарата и аспарагиновой кислоты. Для определения аспарагиновой кислоты фильтрат разводят в 10 — 100 раз, объем проб: 0,2; 0,5 и 1,0 мл.
Чтобы найти содержание белка в иммобилизованных клетках, определяют белок отмывшихся (неиммобилнзованцых) клеток в промывных водах. Для этого к 2 мл тщательно перемешанных промывных вод добавляют 2 мл 2 н. 1чаОН и проводят гидролиз (2 ч при 37 С). Для анализа берут 0,1; 0,4; 0,6 и 0,8 мл гндролизата. По разности в содержании белка в исходной суспензии клеток и промывных водах находят количество белка в иммобилизованнъгх клетках, а затем в 1 мл реакционной смеси.
Результаты вносят в табл. 29.8. Результаты определений фумарата, аспарагиновой кислоты и белка в опыте с иммобилизованными клетками обобщают в табл. 29.9„которую строят по аналогии с табл. 29.7. Таблица 29.8 Исходные данные и результаты определения белка нммобнлнзовавпых клеток Показатель Цнфровые данные 0,2 0,4 О,б Обьсмы гндролнзата белка, взятые для определения, мл Показания ФЭК Содержание белка, мкг: в испытуемых пробах, по калибровочной кривой в 4 мл гндролнзата белка, т.е. в 2 мл промывных вод в общем объеме промывных вод в общем объеме промывных вод, среднее значение (А) в 1,5 мл суспензия клеток, введенных в каррагинан (Б) в нммобнлнзованных клетках, т.е.
в смеси гранул с К-фосфатным буфером (Б-А) в реакционной смеси в общем обьсме в1 мл 351 Т а б л и ц а 29.9 Потребление фумарата и образование аснарагиновой кислоты иммобилизованнымн клетками Е.сод Образсызлссь аспара- гнновов кислоты Количество а реакционной смеси, мг/мл Аспартазная активность клеток, мг кяслоты/(мг белка ч) фумарата % станс- сенного фумарата мг/мг белка клс юк белка ' клсток аспараги- новсй кислоты а начале опыта использо- вано в конце опыта На основании полученных данных сравнившот активность и продуктивность аспартазы свободных и иммобидизованпых клеток.
Результаты оформляют в табл. 29.10. Определение фумарата. Концентрацию фумаровой кислоты определяют спектрофотомстрически по изменению поглощения при 240 нм. Коэффициент молярной экстинкции фумарата — 2530. Учитывая, что все пробы перед определением разводили в 2000 раз, концентрацию фумарата рассчитывают по формуле хМ = АЕ 2000/2530 = АЕ. 0,7905, Таблица 29.10 Образование аспарагиновой кислоты свободными и иммобилизоваиными клепгами Е.са/1 Аспарагинсвая кислота Аспартазная активность клеток, мг аспарагяновой кислоты / (мг белка - ч) Вариант опыта ув от внесенного фумарата мг/мг белка кяюск Своболные клетки -Толуол -~Толуол Иммобилизованные клетки 352 где хМ вЂ” молярность исследуемого раствора; ЛŠ— оптическая плотность раствора.
Зная концентрацию фумарата в молях и его молекулярнук> массу (133), рассчитывактг содержание фумарата в мкг/мл. Определение аспарагииовой кислоты. Содержание аспарагиновой кислоты определяют колориметрическим методом с использованием нингидрина. В пробирку с притертой пробкой вносят 2 мл пробы и 1 мл нингндринового реактива (отобрать с помощью дозатора или резиновой груши). Плотно закрытые пробирки выдерживают 3 лгин (точно!) на кипягцей водяной бане и затем немедленно охлаждают в сосуде с холодной водой. Оптическую плотность раствора измеряют при Х = 500 нм (зеленый светофильтр) в кювете с рабочим расстоянием 1 см.
Окраска / аспарагиновой кислоты с нингидрином стабильна в течение часа. Контрольный раствор получают используя влзесто аспарагиновой кислоты воду. Количество аспарагиновой кислоты в объеме испгятуемой пробы рассчитывагот используя калибровочную кривую. 1 отовят раствор, 1 мл которого содержит 0,5 мкг /;аспарагиновой кислоты. Для этого взвешивают 50 мг аспарагиновой кислоты и растворяют в 100 мл дистиллированной воды (в мерной колбе) с небольшим зюдшелачиванием и осторожным нагреванием. Затем из исходного раствора готовят разведения Та бл и ца 29.11 Схема приготовления стандартных распюров Х-аспарагнновой кислоты н их оптическая плотность (табл.
29.11) с содержанием аспарагиновой кислоты от 50 до 500 мкг (развеления готовить в пробирках с притертыми пробками). Определяют оптическую плотность стандартных растворов аспарагиновой кислоты с нингидрином. На основании полученных результатов строят калибровочную кривую, откладывая по оси абсцисс содержание аспарагиновой кислоты (мкг), а по оси ординат — оптическую плотность. Ниигидриловыйреаитиа включает следующие компоненты: 2 г нингидрина; 20 мл ацетона; 0,5 г хлористого кадмия (Сс1С!з) в 77 мл дистиллированной воды; 3 мл ледяной уксусной кислоты.
В химический стакан вносят нингидрип и заливают его ацетоном. Отмеряют необходимый объем воды и в большей его части растворяют хлористый кадмий. В раствор хлористого калмия вносят ледяную уксусную кислоту и приливают к этому раствору нингидрин в ацетоне. Остатки нингидрина смывают неиспользованным объемом воды. Нельзя приливать кислоту и пипгидрипу! Приготовление раствора фумарата аммония в К-фосфатном буфере. Для приготовления раствора фумарата аммония в К-фосфатном буфере смешивают 1 М раствор фумарата аммония с хлористым магнием с равным объемом О,1 М К-фосфатного буфера (рН 8,0).
бзумарат амлюния готовят нз фумаровой кислоты и амлзиака. 1 М раствор содержит 11б,07 г фумаровой кислоты в 1 л. В мерный стакан гюмещают необходимую навеску фумаровой кислоты, добавляют около половины требуемого объема дистиллированной воды и затем осторожно, небольшими порциями вносят конпентрированный аммиак (до рН 8,0 — 8,5, не выше!). Удобно следить за изменением рН, пользуясь рН- метром, а стакан с фумаровой кислотой держать на магнитной мешалке. При подщелачивании раствора до рН выше 8,5 избыток щелочи нейтрализуют соляной кислотой.
Смесь интенсивно перемешивают стеклянной палочкой, время от времени добавляя новые порции воды, до полного растворения соли. Когда соль распюрится, в раствор фумарата добавляют необходимую навеску М8С1з (из расчета, что в 1 л 0,001 М раствора хлористого магния должно быть 92,5 мг этой соли) и доводят объелз до требуемого уровня. Магний стимулирует реакцию аспартазы. Материалы, оборудование, посуда, реактивы ФЭК; спектрофотометр; рН-метр; ультратермостат (качалка); водяная и ледяная бани; колбы качалочные на 750 и 50 мл; мерные цилиндры; пробирки с притертыми пробками; сито; фарфоровая ступка; химические стаканы на 50 — 200 мл; пробирки; пипетки. План выполнения задачи На выполнение задачи требуется 12 — 15 ч.
Занятие 1. Приготовление и стерилизация МПБ. Посев культуры Есо!! в пробирки со скошенным МПА. Построение калибровочных кривых для белка и аспарагиновой 353 12 п»ч»»со» кислоты. Накануне следующего занятия пересеять суточную культуру Е.сая со скошенного МПА в колбу с МПБ. Занятие 2.
Пр|потовление суспензии клеток. Опыт со свободными клетками. Гидролиз клеток и определение содержания белка в суспензии. Занятие 3. Опыт с иммобилизованными клетками. Занятие 4. Оформление результатов. Глава ЭО ОБРАЗОВАНИЕ И НАПРАВЛЕННЫЙ СИНТЕЗ АНТИБИОТИКОВ-АКТИНОвнИЦИНОВ Антибиотики-актиномицины образуются некоторыми видами стрептомицетов и представляют собой хромопептиды, состоящие из неизменной хромофорной и варьируемой пептидной части молекулы.
Вариации в структуре, сочетании, взаимном расположении аминокислотных остатков пептидных цепей создают многообразие группы актиномициновых антибиотиков. Продуценты актиномицинов, как правило, образуют смесь этих вещеспй компонентный состав которой зависит от вида и штамма стрептомнцста, а также условий его роста и биосинтеза антибиотиков. Направленный биосинтез — изменение не только количества образующегося антибиотика, но и вариаций его структуры и компонентного состава под влиянием факторов среды.
По механизму действия актяномицины относятся к антибиотикам, нарушающим синтез нуклеиновых кислот: молекула актиномицина образует комплекс с определенными участками ДНК, что ведет к подавлению транскрипции. Антибиотики данной группы являются сильными цитостатиками, что определяет их действие не только на микроорганизмы, но и на животные ткани, в том числе злокачественные новообразования. ЗАДАЧА. ОБРАЗОВАНИЕ АНТИНОМИЦИНА И ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОДУКТИВНОСТИ АНТИБИОТИКА КУЛЬТУРОЙ ЗТРЕРТОМУСЕЗ АИШАТьгВ ЧАР.
СНРУВОМАЕШВ бббб~~1.ОР «б Р б б мицета — продуцента актиномнцинов. 2, Изучение образования антибиотиков и определение антибиотической продуктивности при росте стрептомицета на разных средах. 3. Выделение из культуры стрептомицета комплекса антибиотических веществ, их идентификация и определение его компонентного состава в зависимости от добавок к среде разных аминокислот. Ход выполнения задачи Микроорганизмы и их культивирование. В работе используют стрептомицет Юербатусез апи1аГиз уаг. сагузатаПиз (штамм Х~ 2 нз коллекции кафедры мик- 354 робиологии биологического факультета МГУ), который образует комплекс антибиотиков, состоящий в основном из трех актиномицинов: Со Сз н Сз.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
