А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 102
Текст из файла (страница 102)
Для анализа белка берут 0,05; 0,10; 0,15 и 0,20 мл тщательно перемешашгого пшролизата, доводят обьем каждой пробы в пробирках до 1 мл дистиллированной водой, добавляют при постоянном встряхивании 5 мл реактива В (см. ниже) и оставляют при комнатной температуре на 10 мин. Затем к смеси добавляют 0,1 мл реактива Фолина (см. Приложение 4), перемешивают и выдерживают 40 мин в темноте. Оптическую плотность раствора определяют на ФЭКе или спектрофотометре при 660 нм в кювете с длиной оптического пути 0,5 или 1 см. Для приготовления контрольного раствора используют те же реактивы, но вместо гилролизата белка берут НзО. При расчете содержания белка используют калибровочную кривую.
Для построения калибровочной кривой готовит раствор, содержащий в 1 мл 200 мкг бычьего альбумина. Растворяют 1О мг альбумина в 50 мл НзО. Затем из исходного раствора готовят развеления с содержанием белка от 20 до 160 мкг/мл (табл. 29.5). К разведениям добавляют реактивы В и Фолина и определяют оптяческую плотность растворов, как указано выше. Необходимые реактивы готовят следующим образом. Реактив В готовят в день проведения анализа. Его составляют из 50 мл раствора А (2% раствора )чазСО, в 0,1 н.
)заОН) и 1 мл раствора Б. Раствор Б готовят смешиванием равных объемов 1%-го раствора Сп$04 и 2%-го раствора К,Ха-виннокислого (сегнетовой соли). Оформление результатов. Полученные результаты оформляют окончательно в виде сводной таблицы (табл. 29. 6). Рассчитывают активность триптофаназы (мг индола/мг белка) за 30 и 60 мин. Делают заключение о влиянии состава среды на синтез клетками триптофаназы. Т а б л и ц а 29.5 Приготовление растворов альбумяиа для построения калибровочной кривой и их оптическая плотность 346 Таблица 29.6 Активность трнпгофаназы в клетках Е.св7з', выросших на разных средах Материалы, вбарудвваиие, посуда, реактивы Спектрофотомегр или грЭК; ультратермостат на 30 С; центрифуга; качалочные колбы; пробирки обыкновенные и с притертыми пробками; соли и реактивы для приготовления сред и анализов. План вьпюлнення задачи Для выполнения задачи требуется около 20 ч. Занятно 1.
Приготовление и стерилизация сред и посулы. Накануне следующего занятия пересеять культуру Е.соп в пробирки со скошенным МПА и поместить в термостат на 30 С. Занятие 2. Посев культуры в основную среду для получения посевного материала. Построенис калибровочных кривых. Накануне следующего занятия посеять культуру Е.сой в опытные среды. Занятие 3. Приготовление суспензии клеток, определение активности триптофаназы и содержания белка.
Занятие 4. Оформление результатов, обсуждение, зачет. ЗАДАЧА 3. ОБРАЗОВАНИЕ 1.-АСПАРАГИНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЗ ФУМАРАТА АММОНИЯ СВОБОДНЫМИ И ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ КЛЕТКАМИ ЕВСНЕВ!СН!А СОИ Илглгобилизаиил клетпок — это закрепление их тем или иным способом на поверхности или внутри носителя. Основной целью иммобилизации является стабилизация и удлинение срока действия определенных ферментов. С помощью иммобилизованных клеток микроорганизмов можно получать некоторые аминокислоты, органические кислоты, антибиотики и другие практически важные соединения. В качестве носителя при иммобилизации клеток можно, например, использовать каррагинан — добываемый из морских красных водорослей полисахарид, состоящий из сульфата б-Р-галактозы и З,б-ангидро-а- Р-галатсюзьг (мол.
масса 100 — 800 кДа). Производство Е-асцарагиновой кислоты с помощью иммобнлизованных клеток Езсьебсй1а сод было разработано и внедрено в промышленность в Японии в 1974 г. Аспартат образуется в резулыате аминирования фумарата: фумарат + ХН~ -э аспартат. в Задача разработана сотрудниками кзфслры микробиологии биологического факультета МГУ Н.Н. Грсчушкиной, М.Н.Пимсновой, И.В.Авсюк.
Впервые опубликована в кнл Избранные задачи большого практикума по микробислогии. — Мл Изл-во МГУ, 1985. — С. 47 — б4. 347 Реакцию катализирует аспартаза (Ь-аспартат-аммиак-лиаза, НФ.4.3.1.1), кофакторами которой служат ионы магния или других двухвалеитиых металлов. Аспартаза обнаружена у ряда бактерий.
Обычно фермент синтезируется при росте культур на богатых средах„содержащих мясной бульон, пептои, дрожжевой экстракт и т.д. Скорость вылеления аспартата клетками можно повысить, увеличив их проницаемость, например, в результате обработки толуолом. Зйд лычек р бр Е р й «б~пм и иммобилизованными в каррагинан клетками Е.со11 в отсутствие и в присутствии толуола.
Ход выполнения задачи Микроорганизм и его культивирование. Объектом исследования служит штамм Есо11, имеющий высокую аспартазную активность. Полученный из музея штамм пересевают на скошенный МПА и выращивают в течение суток при 30 'С. Для постановки опыта культуру бактерии выращивают в МПБ. В качалочные колбы на 750 мл вносят 150 мл МПБ и стерилизуют при 1 ати. В качестве посевного материала используют 1 петлкз культуры, выросшей на МПА.
Культивирование ведут на качалке при 30 С в течение 19 — 20 ч. Приготовление суспензии клеток. Для приготовления суспензии клеток используют не менее 120 мл культуры. Клетки отделяют от среды центрифугированием (3 — 4 тыс. 8, 10 — 15 мин), супернатант сливают. Для удаления остатков супернатанта центрифужные стаканы с клетками ставят перевернутыми на фильтровальную бумагу.
Затем клетки суспендируют в 3,5 — 4,0 мл 0,85%-го раствора )чаС1, переносят в пробирку и закрывают резиновой пробкой. Для определения содержания белка отбирают 0,1 мл суспензии клеток. Оставшуюся часть суспензии хранят до постановки опытов в холодильнике. Содержание в клетках бактерий белка определяют методом Лоури (см. 29.2). 1. Образование аспарагнновой кислоты свободными клетками. Опыт проводят в двух вариантах, используя клетки, обработанные и не обработанные толуолом (рис.
29.1.). Реакционные смеси готовят в двух колбах на 50 мл. В каждую колбу вносят 9,5 мл 0,5 М фумарата аммония в 0,05 М калий-фосфатном буфере (рН 8,0) и 0,5 мл суспензии клеток. Затем в одну из колб добавляют 0,1 мл толуола. Колбы закрывают ватными пробками и помещают на качалку на 3 ч при 30 С или на 2 ч при 37 С. По истечении указанного времени реакшюнные смеси центрифугируют в сухих центрифужных стаканчиках (3 — 4 тыс. д, 10 — 15 мин). В супернатанте определяют количество аспарагиновой кислоты и фумарата (см. ниже).
Параллельно определяют содержание этих соединений в исходном растворе фумарата аммония в фосфатном буфере. При определении концентрации фумарата аммония супернатант (или исходный раствор фумарата аммония) во всех вариантах опытов разводят в 2000 раз. Для определения исходного содержания аспарагиновой кислоты в растворе фумарата аммония отбирают пробы объемом 0,1; 0,2; 1,0 и 2,0 мл. Для определения количества аспарагиновой кислоты, образованной клетками, берут 0,1; 0,2 и 0,5 мл супернатанта. Супернатант смеси с толуолом предварительно разводят дистиллированной водой в 10 — 100 раз (в зависимости от активности клеток).
348 Рис. 29.1. Схема опьпа со свободными клетками На основании полученных результатов рассчитывают активность аспартазы (в мг образованной аспарагиновой кислоты/мг белка. ч), а также ее продуктивность (количество образованной аспарагиновой кислоты в процентах от внесенного фумарата).
Сравнивают активность аспартазы обработанных и не обработанных толуолом клеток. Результаты вносят в табл. 29.7. 2. Образование асварагииовой кислоты иммобилизоваиными клетками. Иммобилизацил клеток. Иммобилизацию клеток Е.сей осущестшипаг путем их включения в каррагинан (см. схему опыта, рис. 29.2). В химический стакан объемом 50 мл вносят 350 мт каррагинана, добавляют 2 мл дистиллированной воды, закрывают фолыой или часовым стеклом и выдерживают 15 — 30 мин при комнатной температуре для набухания. Добавляют 6 мл 0,85%-го раствора ХаС! и, закрыв фольгой или гасовым стеклом, помещают стакан на кипящую водяную баню.
Смесь непрерывно помешивают покачиванием стакана (стеклянную палочку использовать не рекомендуется). После полного расплавления каррагинана стакан вынимают из бани, охлаждают его содержимое до 50 — 55 С, вносят при непрерывном помешивании 1,5 мл суспензии клеток и быстро ставят стакан в сосуд со льдом (или в воду, налитую поверх ледяного слоя). Таблица 29.7 Потребление фумарата н образование вснарагнннвой кислоты свободными клетками Е. сой Расплавить карратинан в кипяшей водяной бане Охладить на воздухе до 55 — бб С Протереть блок через сиво в арфоровую чашку с 8 — 10 мл 2%-то КО.Смыть транулы с сита 15 — 20 мл этого раствора Перенести гранулы в растворе КС! в цилиндр на 50 мл, отставить на 5 — 10 мин 1ромьпь транулы раза по 20 — 25 мл 2%-м раствором КС! и один раз 20 — 25 мл 0,1 М ~ атного б а Декантация (р-р КС1) П омывные во и Цилиндр на !00 — 150 мл Измерить объем гранул в фосфатном буфере и добавить равный объем ! М раствора фумарата аммония с М8С!з Измерить общий объемм промыаных вод 10 мл пдательно перемешанной смеси+ 0,1М толуола 2мл з-2мл 2 н.)чаОН— тидролиз Качалка, 37 'С, 2ч Определить белок Фильтровать или центрифуги- ровать б — амл, б — Зтыс.об/мин, 1Π— 15 мнн Фильтрат (супернатант) Определить фумарат и аспаратинавую кислоту Рис.
29.2. Схема опыта с иммобилизованными клетками Застывший бпок каррагинана с клетками переносят в стакан со 100 мл 2%-го раствора КС1 (отвсрдителя), охлазкденного в холодильнике, и выдерживают 20 — 30 мин. Блок помещают в сито (диаметр пор около 1 мм), прозрачный слой КС1 удалякзт, а осадок неиммобилизованных клеток вместе с небольшим объемом раствора переливают в мерный цилиндр на 100 — 150 мл. Блок с клетками перетирают через сито фарфоровым пестиком в стакан или фарфоровую чашку, содержащую 8 — 1О мл 2%-го раствора КС1. Гранулы как можно полнее 350 350 мл карратинана+ 2 мл дистиллированной воды, 15 — 30 мин при комнатной температуре (набухание) + б мл 0,85%-то раствора ХаС1 Добавить 1,5 мл суспензии клеток при п<ктш1нном перемешивании и сразу поместить в сосуд со льлом Перенести блок в стакан со 100 мл охлажденного 2%-то раствора КС1, где выдержать 20 — 30 мин Осадок клеток с небольшим количеспюм раствора КС! смывают с сита 15 — 20 мл раствора КС1, переносят в цилиндр на 50 мл и отстаивают в течение 5 — 10 мин.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
