А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 100
Текст из файла (страница 100)
Бактерии выращивают при 37 С в течение 5 — 7 сут. Делан>т смыв клеток с твердой среды матраца дистиллированной водой и полученную суспензию пастеризуют при 80 С в течение 10 мин. Данную суспензию можно использовать на протяжении б мес при температуре хранения не более 5'С. Методы анализов После инокуляции питательной среды (О ч) и в процессе роста стрептомицета через 24, 48, 72 и 96 ч культивирования стерильно отбирают в пробирки пробы (по 7 мл).
Отобранные пробы сразу же анализируют или ставят на хранение в холодильник при -5 'С. О росте стрептомицета судят по увеличению оптической плотности культуры. Биомассу отделяют центрифугированием при 10 тыс. 8 в течение 20 мин. Для определения синтеза антибиотика культуральную жидкость (2 мл) отделяют от клеток в стерильных центрифужных стаканах. В супернатанте (культуральной жидкости) определяют содержание растворимого белка, протеолитическую и а-амилазную активности. Определение количества биомассы не4елометрнчееквм методом.
В основе метода лежит измерение количества света рассеянного суспензней клеток. С этой целью в пробирку наливают 5 мл 50%-го раствора (обьем/объем) глицерина и 0,1 мл культуры Х д аг!!ае, тщательно перемешивают. Глицерин применяют для предотвращения оседания клеток.
Оптическую плотность при 450 нм измеряют в кюветах с длиной оптического пути 1 см на ФЭК илн спектрофотометре. Количество биомассы в пробе определяют по калибровочной кривой с учетом разведений. 339 Для построения калибровочной кривой к 5 мл 50%-го раствора глицерина добавляют 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 мл жидкой культуры стрептомицета и после тщательного перемешивация измеряют оптическую плотность полученных суспензий, как указы ю вьппе.
Затем каждую пробу фильтруют через бумажный фильтр, предварительно доведенный до постоянной массы при 105 С, и промывают биомассу на фильтре физраствором. Фильтр с биомассой доводят до постоянной массы высушиванием в сушильном шкафу при 105 'С.
Сухую биомассу рассчитывают по разности массы фильтра до и после фильтрования. Калибровочную кривую строят, откладывая на осн ординат показания спектрофотометра, а на оси абсцисс — количество биомассы (мг). Определение растворимого белка в еупернатаяте. Определение белка проводят по методу Бредфорд.
В качестве красителя используют кумасси ярко-голубой О-250 (8!8ша, США). Содержание белка в пробе определяют по калибровочной кривой, которую строят по оптической плотности бычьего сывороточного альбумина (БСА). После построения калибровочной кривой проводят определение белка в пробе супернатанта.
Для этого к раствору, содержащему от 30 до 500 мкг белка в 1 мл, добавляют 2,0 мл раствора красгпеля и тщательно перемешивают. Оптическую плотность при 595 нм измеряют в кюветах с длиной оптического пути ! см не раньше, чем через 5 мин, и пе позже, чем через 1 ч после смешивания реагентов. Для сравнения используют контрольную пробу, содержащую О,! мл 0,02 М глрис-НС! буферного раствора (рН 7,8) и 2,0 мл раствора красителя. Определение протеолитичеекой активности. Метод основан на гилролизе окрашенного нерастворимого аналога белка протеолитическими ферментами, находящимися а исследуемом растворе, с последующим определением количества высвободившегося в результате гидролиза белка пи~мента.
В качестве окрашенного аналога белка применяют казвин, окрашенный римазолом ярко-голубым, азоказеин, азоколлаген и другие субстраты. Для определения протеолитической активности с белком, окрашенным римазолом ярко-голубым, 500 мг этого субстрата помешают в фарфоровую ступку, растирают в 5 — 10 мл 0,02 М прис-НС! буфера (рй1 7,5 — 7,8) до получения однородного материала и постепенно, с растиранием, добавляют буфер до объема 40 — 50 мл. Затем содержимое переносят в мерную колбу на 100 мл, остатки белка смывают буфером со стенок фарфоровой ступки, количественно переносят в мерную колбу, доводят буфером объем до 100 мл и получают 0,598-й раствор окрашенного белка.
В пробирку наливают 1 мл раствора окрашенного белка, добавляют 0,5 мл 0,2 М ьзрисНС1 буфера и 0,5 мл опытной пробы (культуральной жидкости), которая разводится в зависимости от содержащегося в ней белка. Пробирки инкубируют в ультратермостате при 37'С 10 мин, после чего содержимое фильтруют через мембранный фильтр «Сынпор № 2» с размером пор 2,5 мкм. В фильтрате спектрофотометрически определяют количество высвободившегося в результате гидролиза белка красителя при Л = 595 нм в кюветах с длиной оптического нуги 1 см. Для сравнения используют контрольную пробу, содержащую 1 мл субстрата, 0,5 мл 0,2 М тряс-НС! и 0,5 мл дистиллированной воды. Для определения протеолитической активности с азоказеином готовят 0,5%-й раствор этого белка в 0,05 М тряс-НС! буфере (рН 7,5 — 7,8), как описано для белка, окрашенного римазолом.
Затем в пробирку наливают 1 мл раствора азоказеина, добавляют О, ! мл 0,1%-го СаС!з и 0,1 мл опытной пробы (культуральной жидкости) и инкубируют в ультратермостате при 37'С 20 мин. Далее в пробирку вносят для остановки реакции и осаждения непрореагировавшего субстрата 2 мл 10%-й трихлоруксусной кислоты. Пробирку выдерживают 30 мин в ледяной бане, содержимое цептрифугируют 15 мин при 10 тыс. 8 и к 2 мл супернатанта добавляют 2 мл 0,5 М 74аОН. Количество высвободившегося в результате гидролиза белка красителя определяют на спектрофотомегре при 440 нм в кюветах с длиной оптического пути 1 см. В контрольную пробу вместо опьггной пробы добавляют 0,1 мл дисгиллированной воды или буфера. 340 За единицу протеолитической активности (Д) принимакп такое количество фермента, которое вызывает увеличение оптической плотности фильтрата на 0,01 ед.
при измерении против контрольной пробы. Протеолитическую акгивность выражают (с учетом разведения культуральной жидкости) в Д/мин мл и Д/мин. мг белка. Определеиие амилолитической активности. Амилаза, образуемая Х/айаг/(ае, гидролизует 1,4-а-связи в амилозе и амилоцектине, из которых состоит крахмал. Активность иамилазы определяют по методу Смита и Роя в модификации Маннинг и Кемпбелл. Метод основан на фотометрическом определении динамики изменения окраски крахмала с йодом под действием фермента. Реаклшвм: 0,1 н. ацетатный буфер (рН 5,0); свежеприготовленпый 1%-й раствор растворимого крахмала (навеску крахмала растворяют на горячей водяной бане, после чего фильтруют) в О,! н. ацетатном буфере (рН 5,0); 0,5 М раствор СаС1Б 1,0 н. раствор НС!; 0,3%-й раствор йода в 3%-м растворе К1. В мерную пробирку А на 25 мл (опыт) наливают 0,2 мл 1%-го раствора субстрата (крахмала); 0,5 мл 0,5 М СаС1, и 1,5 мл 0,1 н. ацетагного буфера.
Те же количества реактивов добавляют в контрольную пробирку Б. Обе пробирки выдерживают при 40 С в течение 5 мин. Затем добавляют 1 мл раствора фермента (культуральной жидкости) в опьпную пробирку А, быстро перемешивают и выдерживают 15 мин при 40 С. В обе пробирки добавляют по 0,5 мл 1 н. НС1 (лля остановки реакции). После этою в пробирку Б добавляют 1 мл раствора фермента (культуральную жидкость). Далее в обе пробирки добавляют 0,1 мл раствора йода.
Обьем жидкости в пробирках А и Б доводят до 25 мл дистиллированной водой и тщательно перемешивают. Оптическую плотность измеряют на ФЭК (филыр М 7 — оранжевый) или спектрофотометре при Х = 610 нм в юоветах с длиной оптического пути 1 см. В качестве контроля используют дистиллированную воду. Действие фермента учитывают по разнице окраски в контроле и опыте (Б — А). Активность фермента (Е) выражают в условных единицах в 1 мин на 1 мл культуральной жидкости (к.ж) с учетом разведения (Е/мин мл к.ж) и на 1 мг белка культуральной жидкости в 1 мин с учетом разведения (Е/мин лп. белка к.ж): (Б — А)25 15 мин Определение автибиотической активности.
Содержание антибиотика тилозина в культуральной жидкости в динамике развития Х /)тийае определяют биологическим методом, основанным на непосредственном биологическом действии антибиотика на используемый тест-организм /3. зиЬгИВ, чувствительный к данному препарату. Точность оиологического метода составляет + 10%, Количество антибиотика в культуральной жидкости определяют методом последовательных разведений.
Используют среду, благоприятную для развития выбранного тест- организма (прозрачный мясо-пептонный бульон). Из пропастеризованной и хранящейся в холодильнике суспензии ВдиЬ!йз пгговят одномиллиардную суспензию по стандарту л~утгюсти. Эту суспензию в количестве 0,5 мл добавлюот к 100 мл МПБ, перемешивают и разливают по 1 мл в 4 ряда стерильных пробирок по 15 пробирок в каждом ряду.
Далее в первые пробирки трех рядов в МПБ с тест-культурой добавляют по 1 мл отцентрифугированной стерильной культуральной жидкости соответствующих отобранных проб (48, 9б и 144 ч) и таким образом данную пробу культуральной жидкости последоватслыю разводят (тест-культурой в М ПБ) в 2„4 и т.д. раз (табл. 29.1). В первую пробирку с тест-культурой в МПБ четвертого ряда (стандарт) вносят стандартный раствор антибиотика (тилозина), который также последовательно разводят (тест-культурой в МПБ в 2, 4, 8, 1б и т.д. раз).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
