А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 97
Текст из файла (страница 97)
Интересный пример: гипсртсрмофил ьные археи Ас(д!апиз т(велиз, ()ези!~иго!обив атббяа1еог способны расти не только в анаэробных условиях благодаря серному дыханию и использования> в качестве донора электронов Нь но и в аэробных, окисляя элементную серу до сульФата. Таким образом, прокариоты, осуществляющие сульфатное и серное дыхание, активно участвуют в круговороте серы в природе, образуя сероводород.
Они участвуют также в круговороте углерода. Особенно важную роль играют эти микроорганизмы в глубоководных гидротермах, где существуют специфические термофильные прокариотныс экосистемы — наиболее близкие аналоги древнейших биоценозов Земли. ЗАДАЧА. ИЗУЧЕНИЕ АНАЭРОБНОГО ДЫХАНИЯ НА ПРИМЕРЕ СУЛЬФАТНОГО Л~гыЖааи — г г л 'г Фюи ~- рующих бактерий, осущсствлиогцнх процесс сульфатного дыхания. 329 Ход выполнения задачи Микроорганизмы и их культивирование. В работе используют несколько представителей сульфатредупируюших бактерий: Рели1/онЬпо г(ези1/иг(санг или Р. Ьаси/агах, а также термофильный Рели!~оготаси1и>п п(я>>/1сапп Среда культивирования (г/л): КН>РО» — 0,5; )ЧН»С! — 1,0; ()ЧН»)>ВО» — 7,0 или )ча>БО» — 4,5; СаС1,.
6Н,Π— 0,06; МЯЛО» 7Н,Π— 0,06; лактат )Ча — 6,0; лимоннокислый )Ча (трехзамегдснный) — 0,3; РеВО» — 0,01; !ЧаС! — 5,0; )ч!агБ . 9Н,Π— 1 мМ (0,22 г/л) в качестве восстановителя; дролокевой экстракт— 1,0; микроэлементы по Пфеннингу и Липперту — 1 мл/л.
Отдельно от основной среды стерилизуют 0,1%-й раствор РеБО» 7Н>О в 1%-й НС1; 5%-й раствор )чагВ 9Н>О в 1%-м растворе )ЧаНСОз; 5 %-йг раствор )ЧаНСОз; 5%-й раствор НС1; 10%-й раствор дрожжевого автолизата (стерилизуют при 0,5 ати, остальные компоненты сред стерилизуют при 1 ати, 30 мин). Раствор микроэлементов вводят в среду при посеве, стерилизуют его также при 0,5 ати. Раствор микроэлементов (по Пфеннингу и Липпсрту) содержит в 100 мл дистиллированной воды (мг): ЭДТЛ вЂ” 500; РеВО» 7Н,Π— 200; Уг>БО» 7Н,Π— 10„ МпС1> 4Н>Π— 3; СоС1> 6Н>Π— 20; НзВОз — 30; )Ч>С1> 6Н>Π— 2; 'Ма>МоО» 2Н,Π— 3,0; СпС1»-2Н>Π— 1, О. После автоклавирования пэрячую среду охлаждают в токе азота и вносят в нес стерильно необходимые добавки в следующем порядке: 1) микроэлементы, 2) дрожжевой экстракт, 3) Ре50», далее доводят рН до 7,0 — 7,5 по бромтимолблау с помошью стерильных 10%-х растворов бикарбоната или НС! и вносят )ча>В по каплям до образования сероватого оттенка в среде.
В среды немедленно вводят посевной материал (5% от объема), разливают под током азота в пробирки Хангейта на 18 мл по 12 мл, а оставшийся обьем заполняют молекулярным азотом. Процесс культивирования ведут в стационарных условиях в термостате при 30 и 60 С (для Р.
л(у!аусат). Хвд анализа. Ежедневно проводят микроскопирование в фазовом контрасте, следя за изменением морфологии клеток. Готовггт препараты клеток для просвечивающей электронной микроскопии (негативное контрастирование). Длгг этого каплю суспснзии клеток (по возможности, без осадка) наносят на сетки, покрытые формваровой пленкой. Через 30 с лишнюю жидкость убирают фильтровальной бумагой.
Затем наносят на сетки на ! мин 2%-й раствор натриевой соли фосфовольфрамовой кислоты (рН 7,0 — 7,2), убирая лишнюю жидкость также с помощью полоски фильтровальной бумаги. Все препараты на сетках после окончания культивирования изучают с помощью трансмиссионного электронного микроскопа 1ЕМ вЂ” 100В (фирма 1ео1, Япония), отмечая изменение морфологии клеток, размер, число н расположение жгутиков.
Подсчитывают число клеток в динамике роста культуры по Виногралскому. Количественный учет биомассы проводят также по приросту белка в культуре, определяемого по биуретовой реакции или по методу Брэдфорд. Определение сульфнлов. В процессе диссимиляционной сульфатредукции клетки вьщслггкгт сегюводорщг, который, связываясь с присутствующим в среде железом, вызывает се почерненис. Определение образовавшегося сульфида в опытных и контрольных пробирках проводят по методу Трюпера. В пробирки Эппендорфа на 1,5 мл вносят 0,2 мл 2%-ного раствора ацетата пинка; 0,01 мл пробы и 0,3 мл Н,О, раствор перемешивают. Приливают 0,1 мл 0,2%-го раствора !ч',!Ч-диметилпарафенилендиамина в 20%-й Н>ЗО», перемешивают.
Приливают 50 мкл 1%-го раствора железоаммиачных квасцов в 2%-й Н>ЗО» и 0,40 мл воды, перемешивают. Через 30 мин интенсивность окраски измеряют 330 на ФЭК при длине волны 802 нм. В качестве контроля вместо пробы берут 0,01 мл воды. Измерение проводят в кюветах с длиной оптического пути 3 мм. Пересчет содержания сульфида ведут с использованием калибровочной кривой, построенной для растворов с содержанием 50 — 200 мкг У на 1 мл (в пересчете на серу). Оформление результатов.
Результаты оформляют в виде таблицы и графиков прироста биомассы и количества образованного культурами сульфида (мкг/ыл) в зависимости от времени по каждой культуре. Рассчитывают интенсивность процесса по часам, делают вывод о различии скорости образования сульфида в зависимости от вида бактерий и условий выращивания клеток. Анализируют микроскопическую картину клеток. Материалы, оборудование, посуда, реактивы Термостаты на 30 и 60'С, ФЭК, микроскоп с фазово-контрасгным устройством; электронный микроскоп (лаборатория электронной микроскопии), пробирки Эппсндорфа на 1,5 мл. Посуда для культивирования анаэробов согласно техники Хаыгейта. Предметные и покровные стекла; необходимые, ранее перечисленные реактивы, фуксин основной.
План выполнения эилачи На выполнение задачи необходимо 15 — 16 ч. Занятие 1. Подготовка сред и посулы лля стерилизапии. Р! остроение калибровочной кривой определения сульфила. Занятие 2. Посев культур в опыт. Отбор проб. Изучение морфологии клеток, подсчет клеток по Виноградскому и определение белка по Брэдфорд или в биуретовой реакции. Занятия 3 — 5. Отбор проб, определение образовавшегося сульфила, лопочет числа клеток, подготовка препаратов для электронной микроскопии, определение белка, расчет продуктивности клеток.
Оформление результатов. Глава 26 МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ Микроорганизмы обладают чрезвычайно высокой способностью приспосабливаться к часто меняющимся условиям окружающей среды. Среди микроорганизмов есть примеры бактерий, способных расти как гетеротрофно, так и автотрофно. Однако поистине удивительную приспособляемость демонстрирует Р. г(елйпЯсапз, организм, дыхательная система которого чрезвычайно напоминает митохондриальную.
Этот организм (или его древний предок) рассматривается в качестве возможного предшественника митохондрий в теории симбиогенеза. Р. Ыет1п7)сало способен расти, используя готовые органические вещества (гетеротрофно) аэробно и анаэробно (восстанавливая нитраты, нитриты и ХзО до Мз), автотрофно„окнсляя водород кислородом воздуха и фиксируя СОт через рибулозобисфосфатный цикл (цикл Кальвина), или на среде с водородом и нитратом анаэробно и, наконец, метилотрофно в аэробных и анаэробных (деничрифицируюших) условиях, используя метанол или формиат в качестве источника углерода и энергии.
Широкая норма реакции генома 331 Р. дел(уг(/)сале на изменяющиеся условия существования позволяет этому организму легко приспосаблинаться к появлению новых субстратов для роста, изменению услоний аэрации, исчезновению органического вещества. Организм хорошо изучен в биоэнергетическом плане, его метаболизм известен, что дает возможносгь предсказать наличие тех или иных ферментативных активностей в клетках после смены условий вырашинания культур. ЗАДАЧА. ИЗУЧЕНИЕ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ ВАРИАБЕЛЬНОСТИ РА1тАСОСС08 ОЕИ!ТИГ!САс/В леаыабжм: ~п ю ф и ° к й й г '4С-метанола и мСОз в зависимости от условий выращивания организма.
Ход выполнения задачи Выращивание Р. дел1ггКсапл. Культуру Р. г(еп1гг(7)сапе АТСС 13543 или )х(С1В 8944 поддерживают на агаризованной среде с дрожжевым экстрактом (2 г/л), глутаматом и малатом (по 20 мМ). Пересевают каждые 6 нед. Суспензию можно хранить в 10 %-м глицероле при — 15 С в течение года. Клетки организма выращивают аэробно на качалке (200 об/мин, 37'С, колбы на 250 мл со 100 мл среды) или анаэробно в бутыли на 1 л с 200 — 500 мл среды с использованием техники Хангейта (см, гл. 16.2). Состав сред. Среда 1 (гетеротрофная, аэробные условия) (мМ): маннит— 20 или сукцинат )ча — 50; КН,РО, — 30; )чазНРО4 — 15; ХН4С1 — 30; МЫ804— 1; )чазМо04 — 0,1; цитрат Ге(ГН) — 0,02; биотин — 4 мкг/мл, рН среды 7,5; стерилизация при 1 ати.
Среда 2 (гетеротрофная, анаэробные условия): та же, что и среда 1, с добавлением К)х)Оз — 20 мМ. Среду разлить по 500 мл в 1 л бутыли, прокипятить, охладить под током азота, закупорить анаэробно и автоклавировать при 1 ати. Среда 3 (метилотрофная, аэробные условия): та же, что и среда 1, но источником углерода служит метанол, берется в концентрации 100мМ. Метанол стерилизуют отдельно в виде 50%-го раствора при 1 ати, добавляют при посеве.
Среда 4 (метилотрофная, анаэробныс условия): та же, что среда 3, с добавлением К)х)Оз — 20 мМ. Готовить и разливать анаэробно, как и среду 2. Среда 5 (автотрофная, аэробные условия): та же, что и среда 1, но источником утлерода служит )х(аНСОз — 0,05 %. Среду разливают по 200 мл в бутыли на 1 л, закупоривают герметично и заменяют газовую фазу на Нз/СОз/Оз в соотношении 70/10/20. Среда б (автотрофная, анаэробные условия): та же, что и среда 5, но с добавлением К)ЧОз — 20 мМ и заменой газовой фазы на Нз/СОз (80/20). Стерилизовать при 1 ати. Каждый студент готовит по одной бутыли со средами 2, 4, 5 и 6 и по две колбы со средами 1 и 3.
Подготовка клеток длв экспериментов. Выросшие культуры из серелииы экспоиенциальиой фазы роста (24 ч; оптическая плотность аэробиых культур — около 4,0; число клеток -10з кл/мл) цеитрифугируют в зечение 20 мии (6200 я, 4 С), отмывают 332 холодной свежей средой без источника углерода и суспендируют в соответствующей среде со всеми добавками аэробно или анаэробно в зависимости от происхождения клеток. Контрольные варианты суспендируют в среде без источника углерода или энергии. Варианты опытов: гсчеротрофно — аэробно/анаэробно;метилотрофно — аэробно / анаэробно; автотрофно — аэробно/анаэробпо.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
