А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 93
Текст из файла (страница 93)
Реактивы для определения: ТХУ вЂ” 4%-й раствор; ВаС1г-желатийг 0,5 г желатина растворяют в 100 мл горячей воды (60 — 70'С), вылерживают 6 ч; 0,5 г ВаС1г 2 — 3 ч растворяют в желатиновом растворе, затем фильтруют а горячем состоянии, раствор стабилен в холодильнике 3 — 4 дня. На основании полученных данных строят калибровочную кривую: по оси абсцисс откладывают концентрацию БО4" (мкг/мл), по оси ординат — оптическую ггглотность растворов. Данные определений заносят также в таблицу.
Оформление результатов. Рассчитанные значения количества ВО»~, содержащиеся в культуральной жидкости, вносят в табл. 24.1. 317 Т а б л и ц а 24. 1 Образование сульфата тионовьвин бактериями Делают вывод о проводимом культурами тиобацилл процессе и сравнивают скорости процесса у разных культур в пересчете на биомассу. Материалы, оборудование, посуда, реактивы Микроскоп; фазоао-контрастное устройство; мерные колбы на 100 мл — 2; на 50 мл — 2; чашки Петри — 5; пипетки на 1 — 2 мл (стерильные) — 18; шпатель — 1; пробирки — 30; реактивы для приготовления сред и определения количества сульфата, грэк.
План выполнения задачи На выполнение задачи требуется 25 — 30 ч. Занятие 1. Приготовление и стерилизация сред„стерилизация посуды. Занятие 2. Посев культур тионовых бактерий, отбор начальных точек, построение калибровочной кривой по сульфату, определение начальной биомассы и содержания сульфатов.
Занятна 3, 4, 5. Микроскопироаание„определение рН, оптической плотности лвух-, трех- и пятисуточной культуры, приготовление реактивов и определение сульфатов, оформление и обсуждение результатов. ЗАДАЧА 2. ОКИСЛЕНИЕ СОЕДИНЕНИЙ АЗОТА. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОДУКТОВ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО МЕТАБОЛИЗМА НИТРИФИЦИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ Нитрифицирующие бактерии относятся к группе хемолитоавтотрофов, получающих энергию для своего роста за счет окисления неорганических соединений азота. Хемолитоавтотрофы образуют клеточньгй материал из СОи а необходимую для этого энергию и восстановительные эквиваленты в виде НАД(Ф)Н извлекают при окислении строго определенного для каждой группы субстрата. 318 Процесс нитрификации, который протекает в почве, навозе, воде и приводит к окислению аммиака до ЫО, н затем до 1чОз, с давнего времени известен в сельскохозяйственной практике и в процессе приготовления селитры для изготовления пороха.
Ло середины Х!Х в., т.е. до работ Л. Пасгера, эти превращения объясняли чисто химическими явлениями. Пастер предположил участие в них микроорганизмов. К бактериям, осуществляющим 1 фазу нитрификации, относятся представители четырех родов: %««озотоиаз, !т!Г«озозр!«а, «/!Г«озососслз, М~«ого!оЬаг.
Дальнейшее окисление Г4О~ до 1чОз, выполняют нитритокисгиющне бактерии: А!!«аюою, Ау!«оЬасге«, Л!г«ососсик Бактерии обеих фаз представляют собой грамстрнцательные, довольно мелкие микроорганизмьь Морфологическое изучение нитрификаторов проводится с использованием фазово-контрастной и электронной микроскопии. Метаболизм нитрифицирующих бактерий характеризуется способностью бактерий использовать лля конструктивных процессов СОз как единственный источник углерода; ассимиляция углекислоты илет через фосфорилированные продукты рибулозодифосфатного цикла, синтез мономсров — через цикл трикарбоновых кислот, который у них, как и у многих облигатных хемоавтотрофов, не замкнут.
Особенности регуляции обмена мономеров обусловливают токсическое действие ряда органических веществ на нитрифицирующие бактерии. Синтез НАДН и получение энергии, необходимой для ассимиляции СОъ происходят в результате окисления неорганических доноров электронов 14Нд и 1ЧО~. При этом, поскольку место входа электронов в дыхательную цепь находится на уровне цитохрома с у аммонийокисляющих и цитохрома а, — нитритокисляюших бактерий, часть аккумулированной бактериями энергии используется на осуществление обратного транспорта электронов против тсрмодинамического градиента для восстановления НАД'. Стандартный окислительно-восстановительный позенциал пары НЛДН/НАД вЂ” 0,32 В, тогда как сгандартные потенциалы пар 1ЧО,/1ЧН,ОН и 1ЧО,/1ЧО, равны соответственно + 0,0бб В и «0„42 В, поэтому для восстановления 1 моль НАД' такими донорами с высоким окислительно-восстановительным потенциалом необходимо затратить энергию около 75 и 143 кДж — это может бьггь достигнуто за счет гидролиза 3 и 5 молекул АТФ соответственно.
В связи с тем что в бактериях имеется всего один пункт генерирования энергии, значительная часть которой используется лля восстановления НАД' против термодинамического градиента, клетки нитрификаторов растут довольно медленно, минимальное время их удвоения — около 24 ч. Г~д~б~: г Р«р ф ы Рш~ ~ Р дуктов энергетического метаболизма нитрифнцирующих бактерий н наблюдение динамики роста клеток.
Ход выполнения задачи Микроорганизмы и их культивирование. В работе используют двух представителей нитрификаторов 1 фазы — Аг!гпиотопиз зр. и М!«озозр!«а ар. и одного представителя 11 фазы — !т!г«обасге«твоя«асЫсу!. Энергетическим субстратом и источником азота для ннтрифнцирующих бактерий 1 фазы является )х1Нм Эти микроорганизмы культивирукп в среде Виноградского (для ! фазы — среда 1) или на среде Сориано и Уокера (среда 2). Среда ! (г/л): (1чН4)тБО4 — 2,01 КтНРО4 — 1,0 (стерилнзуют отдельно); МВБО4 7НзΠ— 0,5; 1КаС! — 2,0; ГеБ΄— 0,05; СаСОз — 5,0; среда 2 (г/л): (1Х(Н4)зБО4 — 0,5; КНзРО4 — 0,2 (стерилизуют отдельно); СаС1г 2НзΠ— 0,04; МВБО„7НзΠ— 0,04; Ге-лнмоннокислый — 0,0005 (стерилизучот отдельно); 1 мл 0,05%-го раствора фенслового красного.
Среды стерилизуют при 1 атн, после чего 319 рН в них доводят до 7,5 — 7,8 с помощью 5%-го раствора 1чаНСО„а в среду 2 вносят также 1 мл стерильного раствора микроэлементов (по Пфеннигу и Липперту, см. приложение 4). Как видно при сравнении сред 1 и 2, они включают одни и те же основные компоненты: фосфор, магний, железо, кальций, однако кальций, введенный в среду 1 в видс карбоната, определяет мутность этой среды (среда 2 прозрачна) и регулирует постоянно меняющийся в процессе культивирования рН. При выращивании нитрификаторов на среде Сориано и Уокера происходит быстрое полкисление среды за счет образования возрастающих количеств нитритов. Уменьшение рН в этом случае можно отметить с помощью универсального индикатора.
Более того, добавленный при посеве индикатор феполовый красный вызывает при подкислении среды изменение цвета культуральной жидкости от сиреневатых до желтоватых оттенков. Аммонийокисляклцие бактерии чувствительны к подкислению среды, поэтому лля сохранения их дальнейшего роста на среде Сориано и Уокера следует с помощью 0,1%-го ХаНСО, ежедневно поддерживать рН в нужных пределах (7,5 — 7,8). Энергетическим субстратом и источником азота для возбудителя П фазы нитрификации является !ЧО~. Для культивирования !ггг оЬасгег гггггоИгагЫгуг, предстаигякпцего эту группу микроорганизмов, используются также среда Виноградского (для П фазы — среда 3) и среда Ватсона и Вотербари (среда 4), Среда 3 (г/л): ХаХОг — 1,0; КзНРО4 — 0,5 (стерилизукзт отдельно); МИИОг 7НгΠ— 0,5; ХаС! — 0,5; Ге804 7НзΠ— 0,005; ХагСОз — 1,0. Среди 4(г/л): !х!а!х!Оз — 0,07, МИКО„.
7НзΠ— 0,1; СаС!з. 6НзΠ— 0,0006; КН,РОг — 0,02 (стерилизуют отдельно). Среды стерилизукгт при 1 ати 30 мин, после стерилизации рН сред доводят до 7,5 с помощью 5%-го !х!аНСОз, а в среду 4 вносят 1 мл стерильного раствора микроэлементов (по Пфеннигу и Липперту). Клетки )ггггоЬасгег к гггаИгисЫгуг', культивируемые в этих средах как представители П фазы нитрификации, в отличие от аммонийокисляющих бактерий не производят при росте заметного сдвига рН среды.
Приготовленные среды разливают по 100 мл в качалочные колбы на 750 мл, стерилпзуют, вносят по !0 мл соответствующей бактериальной суспензии 5— 7-суточного возраста и выращивают на качалке. Некоторое количество среды всех вариантов оставляют незасеянной для определения исходного количества субстратов. Микроорганизмы культивируют на качалке при 30 'С в течение 5 — 7 сут. Жидкие культуры нитрпфицирующих бактерий поддерживают в темноте при 15 С и пересевают каждые 4 — 6 мес. Для аммонийокисляющих бактерий используют среду, содержащую 0,001%-й индикатор феноловый красный, 0,5 М НЕРЕИ- буфера (рН 7,8 — 8,0) и соответствующие соли. Через 6 — 8 нед цвет среды изменится с красного на желтый, указывая на окисление большей части аммония, поэтому в среду вносят дополшггельное количество аммония и доводят рН до нужного значении.
При поддержании нитритокислякгщих бактерий периодически анализируют содержание нитритов и при уменьшении их количества в среду вносят новую порцию Ха!х!О, до нужного уровня. Перед засевом в опыт культуру инкубируют при 25'С в течение нескольких дней на свежей среде. В процессе роста культур изучают динамику окисления бактериями неорганических энергодаюших субстратов. Регистрируют изменение рН в случае нитрификаторов 1 фазы.
320 Определяют сначала наличие (качественные реакции), а при получении положительного ответа — количество )х(Н; и НО! у бактерий 1 фазы окисления, у бактерий П фазы— НО! и )ч Ои Изучение показателей энергетического обмена нитрификаторов проводят в культуральной жидкости после отделения клеток центрифугированием при 6 тыс. я. Полученные данные сравнивают с исходными уровнями окисляемых субстратов, которые определяют в средах, не содержащих посевного материала. Морфологическое изучение нитрифицирующих бактерий проводят с использованием фазово-контрастной микроскопии. ху!гговапхапав вр. — это мелкая, овальная палочка, почти кокковидная; ее размеры 0,6 — 1 х 0,9 — 2 мкм, размножается делением пополам.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
