А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 89
Текст из файла (страница 89)
Для наблюдения за содержанием гликогена в клетках готовят препарат «раздавленная капля» в растворе Люголя и просматривают его с объективом 40х. Таблица 227 Интенсивность дыхания дрожжевых клеток в зависимости от условий их выращивания Таблица 22.8 Размеры клеток дрожжей (длииа и ширина, мкм) ври роете в азробиых и аиаэробиых условиях 305 В каждом препарате следует просчитать не менее 100 клеток (в нескольких полях зрения). Результаты записывают в табл. 22.9. Количество дрожжевых клеток, имеющих почки, подсчитывают в препарате ераздавленная капля» с объективом 40н. Результаты записывают в табл. 22.10.
Количество живых и мертвых клеток дрожжей подсчитывают в препаратах, обработанных раствором метиленового синего. Для этого в пробирке смешивают равные объемы метиленового синего (10 мг/100 мл) и суспензии дрожжей и встряхипад3т в течение 1Π— 15 мин. Мертвые клетки легко адсорбируют краску и окрашиваются в синий цвет. Живые клетки, восстанавливая метиленовый синий, остаются бесцветными. Подсчет ведут в препарате «раздавленная капля» с объективом 40к.
Результат записывают в табл. 22.11. На основании полученных данных составляют отчет, включающий краткий обзор литературы, касающийся метаболизма дрожжей в аэробнь1х и анаэробн'ых условиях и их цитологических особегпюстей, сводную таблицу результатов Таблица 229 Количество клеток дрожжей, содержащих гликоген, прн росте в разных условиях П ри меча н ив. 1 — всего клеток, 2 — клеток с гликогеном, 3 — % клеток с глнкогеном. Таблица 22.10 Количество почкующихся клеток дрожжей при росте в разных условиях Примечание. 1 — всего клеток, 2 — клеток с ночками, 3 — % почкуалнихсл клеток. Т а б л н ц а 22.11 Количество живых клеток дрожжей при росте в разных условиях Примечание.
! — живые клетки, 2 — мертвые клетки, 3 — % живых клеток. 306 опытов, соответствующие графики, а также обсуждение полученных результа- тов в сравнительном аспекте. Материалы, посуда, оборудование, реантивы Скошенный сусло-агар — по 2 пробирки па каждого с|улента; глюкоза; трифенилтетразолий хлористый — 0,3%-й водный раствор; 2 н.
раствор гчаОН; 2,1 н. раствор уксусной кислоты; этанол; раствор Люголя; толуол; раствор метиленового синего (10 мг/100 мл); растворы: КзСг,О, — 42,б г/л; Ге50«()ЧН4)з (солн Мора) — 92 г н Н,ЗО«(пл. 1,84) — 20 г на 1 л волы; К,ге(С1Ч)е — 0,2 г /л; фосфатный буфер 0,05 М, рН 7,0; набор реактивов для приготовления среды, набор реактивов «Фотоэтанол»1 колбы: на 1 л — 1, на 150 мл — 2, колбы качалочные — 2, колбы мерные на 100 мл — 2, на 50 мл— 1; пробирки обычные 12 — !4 штц флаконы на 250 мл — 3; затвор — 1; резиновые пробки; пипетки: на ! — 2 мл — 2, на 10 мл — Ю, на 5 мл — 5; пипетки Мора на 5 мл — 1, на 1 — 2 мл — 2; пипетки Пастера с резиновым шлангом и грушей; лгикропипетки — 2; бюретки на 50 мл — 1; фарфоровая пластинка; воронка; стеклянная палочка; шприц с изогнутой иглой; микроскоп; предметные и покровные стекла; винтовой окулярный микрометр; камера Горяева; качалка; центрифуга; весы аналитические; весы технические; ФЭК; полярограф; прибор для отгонки спирта; водяная баня.
План выполнения задачи На выполнение задачи требуется 55 — 60 ч. Занятие 1.'Пересев дрожжей для получения посевного материала. Приготовление среды и необходимых растворов. Подготовка посуды к сухой стерилизации. Занятие 2. Постановка опыта. Построение калибровочной кривой для определения числа клеток. Занятие 3 — 6. Отбор и анализ проб.
Занятие 7. Отбор и анализ проб. Измерение интенсивности дыхания клеток из аэробного и анаэробного вариантов опыта. Занятие 8. Определение глюкозы в пробах. Определение этанола в пробах с помшцью набора реактивов «Фотоэтанол». Занятие 9. Написание отчета о работе. Занятие 10.
Коллоквиум. Обсуждение результатов, сравнение параметров, полученных с разными расами дрожжей — пекарскими, спиртовыми, винными, пивными. Глава 23 БИОСИНТЕЗ И ФУНКЦИИ КОРРИНОИДОВ В ФИЗИОЛОГИИ ПРОПИОНОВОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ Пропионовокислые бактерии (ПКВ), известные с начала прошлого века и выделяемые из ферментнруемых растительных остатков, молока и твердых сыров, в настоящее время рассматриванпся как компактная филогенетическая линия в домене «грамположительные бактерии с высоким содержанием ГЦ- пар в хромосоме». Они интересны как организмы, неоднозначно относящиеся к молекулярному кислороду и образующие в норме большие количества корриноидов — соединений группы витамина Вп.
Это азротолерантные аназробы (микроазрофилы), основным способом получения энергии которых является пропионовокислое брожение (ПБ), при этом ПКБ имеют редуцированную 307 дыхательную цепь переноса электронов на От и систему ферментов антиокнслительной защиты. Синтез цитохрома г1, действующего в качестве терминальной оксидазы у бактерий, индупируется молекулярным кислородом (при культивировании бактерий на богатых средах без добавления соли кобальта), но для этого конпентрация кислорода в среде должна быть вдвое ниже насыщающей.
В биологии прокариот корриноиды проявляют множественные функпии. В метаболнзме Р. ЯеигУепгегсйй витамин Вп у гаствует в четырех биохимических реакциях: в качестве коферментов метилмалонил-КоА-мутазы — ключевого фермента ПБ, метионинсинтазы и рибонуклеотидредуктазы (РНРазы), а также как субстрат (метилированный кобаламин) в трансметилировании ДНК по цитозину. ПКБ практически значимы как пробиотики, как источники консервантов, применяемых в пищевой промышленности и сельском хозяйстве, а также как продуценты биологически активных веществ„прежде всего витамина Вп ЗАДАЧА.
ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ КОРРИНОИДОВ В ФИЗИОЛОГИИ РЯОРIОМ!ВА СТЕЯШМ РВЕУОЕМВЕ!СНО Ваххаб'~: ю ~ ~~ д~ «ю а клетках Р. угеиделгегсЫ, которое зависит от концентрации ионов кобальта в среде„и ростом бактерий, интенсивностью ПБ, образованием и содержанием ДНК в клетках. Для выполнения задач исследования необходимо: ° культивировать бактерию на глюкозоминеральной и обогащенной триптопом (пептоном) срелах с добавлением и без добавления соли кобальта; сравнить динамику роста вариантов в зависимости от обеспеченности среды ионами кобальта; ответить на вопрос, в каких условиях культивирования ионы кобальта существенны для развития бактерии; ° в случае вариантов, для которых содержание соли кобальта в среде не влияет на рост культуры, измерить содержание суммарных корриноидов (витамина Вп) в клетках; выявить зависимость содержания витамина Вп от концентрации соли кобальта в среде; сделать заключение о необходимости кобальта лля биосинтеза витамина Вп в клетках; ° оценить интенсивность ПБ как основного энергетического процесса в полноценных (Сот ) и дефицитных (Сог ) по содержанию корриноицов в клетках бактерии; ответить на вопрос, требуется ли высокое содержание витамина Вп в клетках для эфФективного ПБ; ° измерить интенсивность образования и содержание ДНК в полноценных (Сот') и дефицитных (Соп) по содержанию витамина Вп в клетках; сделать заключение о наличии корреляции между количеством корриноидов в клетках и эффективностью образования ДНК.
Ход выполнения работы Микроорганизм и его культивирование. Р.Яеиг(елгегспйаоЧтр. зйеппалй, ВКМ- 103 выращивают на средах следующего состава. Среда 1 — глюкозоминеральная (минимальная, или основная): глюкоза (г л ') — 20„0; макроэлеленты (есоле- 308 вон фонэ среды — СФС„г л-'): (!ч Н»)з80» — 3,0; КНгРО» — 1,5; М880» 7Н,О— 0,25; ликразлеиеил»ы (мг л '): !ЧаС! — 5,0; Мп804. 5Н,Π— 5,0 или МпС!з. 4НзО— 4„0; Уп80» 7НзΠ— 0,01; РеС!з бНз0 — 0,005; СоС!» 6НзΠ— 1,0 — 1,5; вити- лины (мкг. л-'): пантотенат кальция — 1000; тиамин — 200; биотин — 1,0; вода дистиллированная; рН среды 6,8 — 7,0.
Среда 2 — среда 1 без добавления кобальта. Среда 3 — среда 1, дополненная 0,05%-м триптоном или 0,1%-м пептоном. Среда 4 — среда 2, дополненная 0,05%-м триптоном или 0,1%-м пептоном. Раствор микроэлементов готовят отдельно (из расчета 1 мл на 1 л среды) и добавляют в среду до стерилизации. Глюкозу, витамины и хлорид кобальта стерилизуют по отдельности, готовя растворы из расчета: глюкоза — 100 мл на 1 л среды, витамины и хлорид кобальта — 1 мл на 1 л среды. Режим стерилизации: основная среда, глюкоза и хлорид кобальта цри 0,5 атм (30 мин), витамины — 0,5 атм (15 мин).
Культуру выращивают на средах 1 и 2 в колбах Эрлен- мейера объемом 100 мл с 50 мл среды и на средах 3 и 4 в колбах Эрленмейера объемом 750 мл с 500 мл среды. Культивирование проводят при 30 'С периодическим способом в стационарных условиях (при свободном доступе воздуха: концентрация кислорода -0,024 мМ, или -0,7 мг. л '). В качестве посевного материала используют 48-часовую культуру, выращенную на той же среде. Объемная доля посевного материала — 10 % На средах 2 и 4 культуру предварительно пассируют 2 — 3 раза. Ежедневно подводят рН культур до значения 6,8 — 7,0 (зеленый цвет индикатора бромтимолового синего в капле раствора на поверхности белой кафельной плитки) с помощью стерильных !0%-х растворов )ЧаНСО, и Нз80» Время культивирования — 72 ч.
Пипетки, используемые при работе с вариантами 1 и 3, необходимо готовить и содержать отдельно во избежание попадания ионов кобальта в остальные растворы. Рост бактерий оценивают нефелометрическн, измеряя поглощение при 540 нм дважды в сутки. Отдельно строят калибровочную кривую для перевода значений оптической плотности культур в граммы абсолютно сухой биомассы (АСБ). АСБ определяют гравиметричсски, используя клетки, оставшиеся после завершения опыта. Измерение содержания суммарных корриноидов (витамина Вы) проводят в клетках 72-часовых культур (варианты 3 и 4, которые соответствуют номерам сред).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
