А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 90
Текст из файла (страница 90)
Определение микробиологическим методом общего содержания кобаламявов в виде их цианоформ проводится с помощью тест-культуры Езс!»епе!»1а сод ! !3-3 по Каноикайте (1978) в модификации. Штамм Е. сой 1! 3-3 является ауксотрофом по кобаламнну. Кобаламин необходим бактерии для синтеза метионина. Метов основан на том, что в определенном диапазоне количество кобаламнна в среде пропорционально интенсивности роста бактерии, которую измеряют нефелометрнчески. Чувствительность метола: 2 — 4 нг витамина Вп в образце. Культуру Е. сод 113-3 цодцерживают, выращивая втечение 24 ч при 37 С в пробирках со скошенной агарнзованной средой состава (г л '): триптон — 6,0; К,НРО» — 0,2; Ре80».
7Н,Π— 0,005; Е-аспарагин — 0,2; глицерин— 2,0; цианкобаламин — 0,0001; агар — 15,0; вода дистиллированная, рН 7,0. Культуру хранят при 6 С. Частота цересева — 1 раз в 3 мес. Для определения витамина готовят основную среду (ОС) состава (г.л '): глюкоза — 2,0; К,НРО» — 7,0; КН,РО, — 3,0; натрий лимоннокислый — 0,5; (!ЧН»)фО» 1 0' М880»'7НрΠ— 0,1; !чаС! — 0,5; !ча!чО,— 0,01; вода дистиллированная, рН 6,8 — 7,0.
309 Для получения калибровочной кривой используют стандартный водный раствор витамина Вп (цианкобаламина, СХ-СЫ) с концентрацией 5 1О-' мкг. мл '. За сутки до проведения опьпа готовят посевной материал. Для этого Е. сей (штамм 113-3) пересевают с агаризованной среды в пробирку, содержащую 5 мл ОС и 5 мл стандартного раствора цианкобаламина, и выращивают 20 — 24 ч при 37 С.
В испытуемом образце кобаламины предварительно переводят в раствор и стабилизируют в виде нитритной формы. Для этого к 1 мл хорошо перемешанной культуры в пробирке, градуированной иа 10 мл, добавляют 4 мл дистиллированной волы и 2 мл 0,1%-го раствора )Ма)'!О, Затем доводят рН до 4 — 5 с помощью О, ! п. раствора НС! и нагревают ее в кипящей водяной бане в течение !5 мин. Пробирки охлаждают, растворы нейтрализуют сухим ХаНСОз (рН 7,0), объем жидкости доводят дистиллированной водой до 10 мл. Образцы хранят в холодильнике.
Исследуемые образцы могут содержать метионин, который также поддерживает рост Е. сой 113-3, поэтому параллельно рекомендуется проводить контрольный анализ образцов, в которых кобаламины предварительно разрушены. Для этого в подготовленные образцы добавляют МаОН до концентрации 0,1 н., нагревают их 20 мин на водяной бане, охлаждают и нейтрализуют 0,1 н.
НС1. Для получения калибровочной кривой в широкие пробирки со стерильной ОС (5 мл) добавляют стандартный стерильный раствор СХ-СЫ (5 10 з мкг мл ') в количестве: 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 мл, что соответствует 0,025; 0,05; 0,075 и 0,1 мкг СХ-СЫ. Подготовленные опытные образцы добавляют в количестве от 0,5 до 4,0 мл (например, по 0,5; 2,0 и 4,0 мл). Объем среды в пробирках доводят стерильной дистиллированной водой до 10 мл. Культуру (0,1 мл), используемую в качестве посевного материала, суспендируют в 10 мл 0,9%-го стерильного раствора ХаС!. Посевной материал вносят в количестве 1% (по объему). Выращивание проводят в течение 20 — 24 ч при 37'С. Рост определяют, измеряя оптическую плотность при 540 нм. Для проведения спектрофотометрического определения кобаламины освобождают из клеток в водный раствор путем гидролиза, переводят в гцлроксильные производные и измеряют поглощение при длине волны максимального поглощения соответствующих производных кобачамина.
Полученное значение пропорционально концентрации кобаламина. Чувствительность метода — 10 — 100 мкг кобаламина в пробе. Клетки из 200 мл 72-часовых культур вариантов 3 и 4 собирают центрифугированием (6 тыс. я, 15 мин), количественно помещают в колбы на 250 мл путем суспендирования клеток в подкисленной до рН 4,6 — 5,0 дистиллированной воле (-30-кратный объем по отношению к объему сырой биомассы). Корриноиды экстрагируют путем нагреваньи суспензии в кипящей водяной бане в течение 45 мин. После охлаждения осадок отделяют цептрифугированием (6 тыс. я, !5 мин).
Супериатант должен иметь рН 4,6 — 5,0. В суммарном препарате могут присутствовать разные производные кобаламина, различающиеся по коэффициентам экстинкции и максимумам поглощения. Поэтому корриноиды переводят в форму гидроксильных производных путем помещения раствора под лампу накаливания (60 Вт) на расстоянии 25 см на 30 мин. Измеряют конечный объем раствора. Определяют поглощение при длине волны, соответствующей максимуму поглощения гидроксикобаламина (ОН-СЫ) — 530 нм. Суммарное содержание корринондов в 1 л культуры рассчитывают по формуле Аззо К~ 10 где С вЂ” содержание корриноидов, ммоль.
л ' исследуемого раствора; Ад, — оптическая плотность при Х = 530 нм, толщина кюветы 1 см; Х вЂ” коэффициент миллимолярной экстинкции (лля ОН-СЫ К = 56); 1'~ — объем раствора (гндролизата), мл; $'~ — объем культуры, из которой собрана биомасса, мл. 310 Для выражения содержания коррииоидов в весовых единицах необходимо использовать величины их молекулярной массы. Для ОН-СЫ оиа ранна ! 341. Однако большая часть корриноидов Р. г«еиНеп«е1сла представлена аналогом кобаламина — кобииамилом, ис содержащим а-лиганд (иуклеотид с основанием 5,6-диметилбсизимилазол, 5,6-ДМБ).
Молекулярная масса производных этого аналога -1000 — ! 100. Поэтому обычно за несколько часов до измерения в культуру вводят 5,6-ДМБ (1О мг л-'), И!пенсивность и характер пропионовокислого брожения (ПБ) оценивают по количеству и соотношению выделяемых бактерией в культуральную жидкость пропионовой н уксусной кислот. Качественное и количественное определение летучих кислот проводят методом газожидкостной хроматографии (Методы общей бактериологии, 1984). Кюп4бровку колонок ГЖХ проводят растворами пропионовой и уксусной кислот.
Анализ кислот проводят в культу- ральной жидкости 72-часовых культур вариантов 3 и 4. Культуральную жидкость отделяют от клеток центрифугированием (6000 я, 15 мип). К 100 — 200 мкл образца приливают 1 мл 0,02 н. НС1. Раствор вводят через фильтрующую насадку. Колонка размером 1000 х 4 мм заполнена полиэтиленгликольадипатом на хромосорбе В'.
Скорость потока водорода в пламенно-ионизационном детекторе — 40 мл мин ', температура — 240 'С в испарителе и 130 С в колонке. Газ-носитель (азот) подается в колонку под давлением 70 кПа. Результаты хроматографии регистрируют и обрабатывают с помощью компьютерной программы. Интенсивность образования ДНК оценивают по скорости включения меченого аденина во фракцию ДНК в процессе инкубирования суспензий клеток (60 — 90 мин).
В опьгге сравнивают варианты Р. 7«епс!ен«е1сЛй (Сот' и Сот ), выращенные на средах 3 и 4 в течение 65 — 72 ч. Для измерения интенсивности образования ДНК готовят следующие раствори: раствор 18 мС)аленина (ПО «Изотоп»ч С.-Петербург; удельная радиоактивность 10 — 12 ГБк. г ') 37 МБк в 500 мкл дистиллированной воды; раствор аденина 2 мг в 1,0 мл дистиллированной воды (порошок аленина растворяют прн нагревании, по каплям подкисляя раствор с помощью 0,1 н. НС1); 200 мл раствора СФС + 0,5 % глюкозы, рН 7,2 (хранить в холодильнике); 20 мл раствора 1,2 н. КОН; 40 мл раствора 0,6 н.
НС1; 70 мл раствора 2 н. НС106 200 мл раствора 0,3 н. НС10„; 250 мл 70%-го водного раствора этилового спирта; 200 мл сцивтилляционной жидкости ЖС-106. В 5 чашек Петри помещают бумажные фильтры, разделенные пополам (карандашом), обозначенные цифрами 3 и 4; на крышках пишут время: О, 20, 40, 60, 80 мин. Клетки из 40 мл 65 — 72-часовых культур вариантов 3 и 4 собирают центрифугированием (6 тыс. я, 15 мин), ресуспендируют на холоду (+6'С) в 12 мл СФС с 0,5%-й глюкозой (рН 7,2)„измеряют оптическую плотность (Аз,с) при разведении в 10 раз. В 10 мл суспензии вводят [8 '»С)аленин (74 10з Бк. мл ') и немеченный аденин (5 мкг мл '), инкубирук>т 5 — 10 мнн при 37 'С и отбирают пробы по 0,5 мл с интервалом в 20 мин в трех повторностях (в точках О, 20, 40, 60, 80 мин).
Пробы помещают в пробирки с 0,5 мл 1,2 н. раствора КОН и оставляют на ночь при 37 "С для щелочного гидролиза РНК. Щелочь в образцах с радиоактивной ДНК нейтрализуют добавлением 1 мл 0,6 н. НС) (при комнатной температуре). Растворы ДНК охлаждают до 0 С и приливают к ним по 2 мл холодного раствора 2 н. НС104.
Пробирки оставляют при Π— 6 'С не менее чем на 4 ч. Осадки, содержащие ДНК, собирают на мембранных фильтрах, 311 которые с помощью пинцета (матовой стороной вверх) помещают в воронку Бюхнера, соединенную с колбой Бунзена и водоструйным насосом. Осадки промывают растворами холодной 0,3 н. НС1О«(3 объема по отношению к исходному раствору, 12 ыл на каждую пробу) и 70%-го этилового спирта (2 объема, 8 мл). Затем фильтры высушивакп на воздухе, помещают во флаконы (осадком вверх) и заливают сцинтилляционной жидкостью ЖС-106 (по 5 мл).
Радиоактивность измеряют на автоматическом счетчике. Содержание ДНК определяют в клетках 72-часовых культур вариантов 3 и 4 одним из следующих методов. Колориметрическое определение ДНК с дифеяиламииовым реактивом в экстракте нуклеиновых кислот из клеток хлорной кислотой (Методы общей бактериологии, 1984).
Чувствительность метода 5 — 50 мкг ДНК - мл '. Для приготовления хлорного экстракта клетки из 1О мл культуры собирают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл 10%-й НС1О«, нагревают в течение 15 мин в кипящей водяной бане, центрифугируют и в супернатанте определяют содержание ДНК. Для определения используют следующие реактивы: Реактив. А: 1,5 г дифениламина растворяют в 100 мл ледяной уксусной кислоты и добавляют 1,5 мл концентрированной НзЗО«. Реакгиив В: 0,5 мл уксусного альдепша растворяют в 25 мл дистиллированной НзО.
Реактив С: непосредственно перед определением смешивают 20 мл реактива А и 0,1 мл реактива В. К 1 мл экстракта, содержащего ДНК, добавляют 2 мл реактива С и выдерживают 14 ч при 37 С. Измеряют поглощение при 600 нм. Калибровочную кривую строят, используя стандартный раствор ДНК в 10%-й НС1О„. Диапазон концентраций ДНК 20 — 100 мкг.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
