А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 91
Текст из файла (страница 91)
мл ', Определение ДНК в бесклеточном экстракте с коммерческим реактивом «Хекст» (НоесЬз! 333258) проводят на специализированном минифлуориметре или спектрофлуориметре. Для приготовления бесклсточного экстракта клетки суспендируют в СФС, рН 7,5 (нестерильно) в соотношении вес (сырой биомассы): объем СФС = 1: 4. Затем производят ультразвуковую обработку суспснзий на УЗДН-2Т в режиме: 22 кГц, 40 мкА. 10 раз по 30 с при двухминутном охлаждении (О С) межлу озвучиваниями. Фрагменты неразругпенных клеток удаляют центрифугированием (30 тыс.
е, 20 мин, '6 С, центрифуга фирмы «ВесЬпап», США, модель 32-21, центрифужные стаканы на 50 мл с крышками). Рабочий раствор реактива «Хекст» должен содержать ! мг сухого вещества в 1 мл буферного раствора (БР): 0,01 М карис-НС1 (РН 7,4) + 1 мМ ЭДТА+ 0,1 М )заС1. В мерную колбу, содержащую 100 мл БР, следует внести 1О мкл рабочего раствора реактива «Хекст», При измерении концентрации ДНК с помощью спектрофлуориметра проводят его калибровку с помощью стандартного раствора ДНК в буферном растворе реактива «Хскст, Предварительно следует найти значения длин волн максимального поглощения и максимального испускания света (флуорссцснции) стандартным раствором.
После этого можно проводить измерение интенсивности флуоресцснции в опытных растворах ДНК и рассчитывать се концентрацию (мкг. мл ') по стандартной кривой. Перед измерением прибор устанавливают в 0-положение. Для этого в камеру ставят пустую кювету, поворачивают ручку «вса1е» вправо, до упора; ручкой «гега» выставляют «000» на табло. Затем в кювету вносят 2 мл буферного раствора с реактивом «Хекст», добавляют 2 мкл стандартного раствора ДНК (100 мкг мл-') и ручкой «веа1е» выводят на табло это значение. Для измерения концентрации ДНК в опытных образцах в кювету также вносят 2 мл буферного раствора с реактивом Хекст» и добавляют 2 мкл исследуемого препарата. Показание (концентрация ДНК, мкг л-') высвечивается на табло.
Чувствительность метода — 10 мкг мл '. 312 После проведенных измерений сравнивают концентрацию ДНК в клетках вариантов 3 и 4. Содержание ДНК рассчитывают в 1 г АСБ (с учетом разбавления суспензии). Для того чтобы точнее сравнить содержание ДНК в препаратах вариантов 3 и 4 следует измерить в них концентрацию белка и рассчитать отношение ДНК/белок. Концентрацию белка »южно измерить любым из известных способов (см. гл.14). Материалы, посуда, оборудование, реактивы Оборудовиние (в расчете на ~руппу студентов): центрифуга с охлаждением (6 тыс, «); центрифуга с охлаждением (30 тыс. я)„воздушный и водяной термостаты с температурой 30 и 37 С; водоструйный насос; газожидкостный хроматогроф (ГЖХ, например СНКОМ 4, х!ешская Республика), оборудованный пламенноионизационпым детектором и колонкой, размером 1000 х 4 мм), заполненной полиэтиленгликоль-адипатом на хромосорбе 11', рН-метр; ультразвуковой дезинтегратор УЗДН-2Т (Россия); спсктрофотометр с диапазоном длин волн 260 — 600 нм; спектрофлуориметр (например, фирмы «Зоб[п 1«оп», Франция) и/или минифлуориметр (ТКО 100-дед[са1ес1 пнп1 Оцог[шегег, Нос(ег Яс1епййс !пзгпппепгз, США); автоматический счетчик радиоактивности (например, фирмы «Рпагшас[а-!.КВ», Швеция).
Посуда и инструменгпы (в расчете на 1 студента): для приготовления стерильных сред 1 — 4: колба или другая посуда объемом 2 л. Посуда с ватными пробками: цилиндр или градуированная колба на 50 мл, 4 колбы на 250 мл, одна обычная пробирка, две широкие пробирки; колбы Эрленмейера (две на 100 мл и две па 750 мл или на 1 л), одна колба на 100 мл (на группу). Стерильные пипетки: на 10, 5 (по 2 шт.), 2 и 1 мл (по 5 шт.).
Для определения суммарных корриноидов (витамина Вц) в культурах и клетках: колба (на 250 мл) для приготовления «основной» среды (ОС); 2 стерильные пробирки (одна из них со стерильной дистиллированной водой, 5 мл), 20 широких пробирок с ватными пробками, градуированных на 10 мл; пипетки на 2, 5 и 10 мл (по 4 шт.); пробирки, градуированные на 10 мл (2 пгг.); центрифужные стаканы (на 250 мл, 4 шт,), 2 колбы (на 250 мл, желательно с притертыми крышками). Для регистрации биосинтеза (образования) ДНК в клетках: химически чистые пробирки (32 шт.); автоматические пипетки: на 1 мл с переменным объемом и с фиксированными объемами на 50 и 20 мкч; носики на ! мл, 50 и 20 мкл; штативы для пробирок и ашоматических пипеток; пипетка на 10 мл (со специальным устройством для отбора агрессивной жидкости); мембранные фильтры диаметром 25 мм, с порами диаметром 0,4 или 0,6 мкм.„колба Бунзена с воронкой Бюхнера; 5 чашек Петри с бумажными фильтрами на дне, разделенными (карандашом) на две части; флаконы для счета радиоактивности (30 шт.); 4 колбы на 100 — 250 мл (желательно с притертыми крышками); 2 цилиндра на 50 или 100 мл; пинцет; секундомер; резиновые перчатки.
Для получения гомогенатов клеток (при измерении ДНК); 2 химических стакана объемом 50 — 100 мл, секундомер, центрифужные стаканы с крьппками (на 50 мл, 4 шт.), колба на ! л. Реактивы, рис«оводы и истомм «пест-культуры (для определения вгпамина Вп): ° глюкоза (чда); соли (хч или чда); (['[Н«),БО«; КН,РО,; МяБО« 7Н,О; триптон, например Тпр!оп Вас!о («Регас», Вегйп); понтон (Бег«а, Германия) или гидролизат казеина (Россия); ЬаС!; МпБО«5Н~О; лпЯО 7НзО; РеС!з- 6Н2О; биотин; тиамин; пэнтотенат-Са; 10%-е растворы [х[аНСО, и НзЗО,; индикатор рН бромтимолблау; ° Е.
сой, штамм 113-3; цианокобаламин (СЙ-СБ1, Россия); На!ЧОт; К,НРО«; натрий лимоннокислый; раствор 0,1 М НС!, 0,9%-й [х[аС! (10 мл — на группу); ° газы в баллонах: азот и водород; водные растворы уксусной и пропионовой кислот; ° нестерильный СФС+ 0,5%-я глюкоза (50 мл, рН 7,0); аденин («Химреактив», Москва), [8 '«С)аленин (ПО «Изотоп», С.-Петербург; удельная радиоактивность 10 — !2 ГБк. г'); 313 растворы: 1,2 н.
КОН; 0,6 н. НС1; 2 н. НС1О«1 0,3 н. НС1О„70%-й водный раствор эгилового спирта; сцинтилляционная жидкость ЖС-106 (ПО «Изотоп», С.-Петербург); ° СФС (без глюкозы), рН -7,5; мелкис кусочки льда; реактив «Хекст» (Ноеспзг 333258, НоеГег Бсюпббс 1пмпппепгз, Кап Ргапс)зсо, ОЗА, 100 мг)1 буферный раствор 0,01 М гадис-НС1, содержащий 1 мМ ЭДТА и 0,1 М 14аС!. План проведения работы На проведение работы необходимо 60 ч. Занятие 1. Приготовление и стерилизация сред и посуды для культивирования Р. угеидедге(сбп'. Занятие 2. Завершение приготовления сред для культивирования Р.
7«еи«1еяге(сияй Посев культуры. Приготовление и стерилизация основной среды и среды для предварительного культивирования Е. соб 113-3. Приготовление стандартного раствора витамина Вп (пианокобаламипа). Занятие 3. Измерение оптической плотности и подведение рН растущих культур. Приготовление буферного раствора для измерения ДНК в гомогенате клеток с реактивом «Хекст» и льда для разрушения клеток на ультразвуковом дезинтеграторе (хранить в холодильнике). Подготовка растворов для измерения интенсивности образования ДНК по включению меченого аленина в шелочестабильную кислсггонерастворимую фракцию клеток.
Занятие 4. Измерение оптической плотности и подведение рН растуших культур. Приготовление растворов меченого и немеченого аденина. Калибровка колонок ГЖХ пропноновой и уксусной кислотами. Занятие 5. Измерение оптической плотности и подведение рН во всех вариантах культур. Проведение предварительного посева тест-культуры (Е. со(1 113-3) для определения витамина Вп. Подготовка и стерилизация образцов для определения витамина В и в культурах вариантов 3 и 4 микробиологическим методом. Проведение с этими же вариантами опыта по измерению интенсивности образования ДНК до стадии щелочного гидролиза РНК.
Отбор по 200 мл культур этих же вариагггов для определения витамина Вп спектрофотомстрическим методом и для измерения содержания ДНК в гомогенатах клеток, которые хранятся в хо«юдильнике до следуюшего занятия. Занятие 6. Нейтрализация щелочи в образцах с радиоактивной ДНК. Образцы хранятся в холодильнике до следующего зюития. Посев Е сой 113-3 в образцы для проведения микробиологического определения витамина Вп.
Сбор биомассы вариантов 3 и 4 центрифугированием для спсктрофотометрического измерения содержания суммарных корриноидов и для измерения содержания ДН К в гомогенатах клеток. Отбор культуральной жидкости для определения летучих жирных кислот. Занятие 7. Измерение роста тест-культуры с препаратами витамина Вп. Расчет содержания корриноидов по стандартной кривой.
Продолжение обработки образцов радиоактивной ДНК. Определение радиоактивности образцов. Занятие 8. Определение содержания корриноидов спектрофотометрическим методом. Расчет суммарного содержания корриноидов в 1 л культуры. Занятие 9. Определение содержания ДНК в гомогенатах клеток вариантов 3 и 4 с реактивом «Хекст» (НоесЪ1 333258). Определение количества пропионовой и уксусной кислот в культуральной жидкости.
Занятие 10. Оформление результатов. Построение кривых роста культур вариантов 1, 2, 3, 4. Выявление различий. Сравнение данных по общему содержанию корриноидов, полученных микробиологическим и спсктрофотометрическим методами. Расчет радиоактивности ДНК. Построение кривых включения меченого аденина в ДНК для вариантов, различаюшихся по уровню образования корриноидов. Расчет количества летучих кислот, образованных вариантами культур Р. Ггеи~етекбй, различающихся по содержанию корриноидов в клетках. Обсуждение полученных результатов. 314 Глава 24 ПОЛУЧЕНИЕ ЭНЕРГИИ ЛИТОТРОФНЫМИ БАКТЕРИЯМИ ЗАДАЧА 1.
ОКИСЛЕНИЕ СОЕДИНЕНИЙ СЕРЫ СЕРНЫМИ (ТИОНОВЫМИ) БАКТЕРИЯМИ Микроорганизмы, окисляющие соединения серы, можно разделить на три группьп Фотосинтезирующие (окрашенные бактерии), бесцветные серобактерии и тионовые бактерии. Фотосинтезирукщ(ие бактерии окисляют сероводород и серу в анаэробных условиях на свету.
Серобактерии окисляют сероводород кислородом воздуха и могут откладывать капли серы внутри клетки. Предполагают, что сера, которую откладывают в клетках бесцветные серобактерии, может быть использована как акцептор электронов цри окислении органических веществ в анаэробных условиях, например при нахождении бактерий в илах. Считают также, что окисление сероводорода иногда может иметь защитное значение для бесцветных серобактерий, не обладающих каталазной активностью.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
