А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 87
Текст из файла (страница 87)
Приготовление и сгерилизация питательной среды для периодического процесса в ферментере. Занятие 5. Посев культуры в ферментер для периодического выращивания бактерий, отбор проб и определение в них интенсивности свечения и оптической плотности. Знакомство с методом графоаналгггического расчета условий непрерывного культивирования.
Занятие 6. Отбор проб из ферментера, определение свечения и оптической плотности. Слив ферментера, подготовка к стерилизации и стерилизация ферментера. Расчет условий непрерывного культивирования клеток. Занятие 7. Посев культуры в ферментер для непрерывного культивирования бактерий, отбор проб для определения оптической плотности и свечения.
Перевод культуры на непрерывный процесс выращивания, отбор проб, проведение анализов, построение графиков кривой роста культуры. Занятие 8. Слив ферментера, разборка и мойка. Отделение биомассы, разрушение на прессе или ультразвуком, определение ферментативных активностей и количества АТФ. Построение таблиц и графиков. Оформление результатов задачи с использованием компьютера.
Зачет. П р и м е ч а н и е. Поскольку выполнение задачи требует каждолневной работы, целесообразно проводить ее во время учебной практики студентов. 298 Глава 22 МЕТАБОЛИЗМ ДРОЖЖЕЙ Дрожжи имеют большое значение в хозяйственной деятельности и жизни человека. Их традиционно используют в хлебопечении, виноделии, пивоварении и т.д. Биомасса дрожжей является источником белка, витаминов, липидов и других ценных веществ. Термин «дрожжи» не несет таксономической нагрузки, а объединяет одноклеточные эукариотные микроорганизмы, которые в зависимости от наличия и типа полового процесса относятся к трем разным классам грибов. Дрожжи, использусмыс в производстве, относятся к классу Азсотусегее, роду ЮассЬагатусее.
В зависимости от степени аэрации среды дрожжи получают энергию либо в результате спиртового брожения, либо в результате аэробного дыхания. Таким образом, изменяя условия культивирования, возможно направлять метаболизм дрозкжей на получение метаболитов (этанол, СО1) или биомассы. Условия выращивания дрожжей сказываются также на скорости их роста, времени генерации, скорости потребления субстрата, а также на их морфологии и цитологии. ЗАДАЧА. ИЗУЧЕНИЕ МЕТАБОЛИЗМА ДРОЖЖЕЙ В АЭРОБНЫХ И АНАЭРОБНЫХ УСЛОВИЯХ л»»»»юо»» а» о г»г ю, пФ физиолого-биохимические особенности при культивировании в разных условиях аэрации. Ход выполнения задачи Микроорганизмы и условия культивирования.
В работе используют разные расы дрожжей оасслагатусее сегеих1ае: пекарские, винные, спиртовые, пивные. Посевной материал выращивают в пробирках на скошенном сусло-агаре (6 'Б, 2 % агара) в течение 2 сут при 30 'С. Затем биомассу смывают стерильной водой и переносят по 3 — 4 мл в каждый сосуд для культивирования. Дрожжи дяя опыта выращивают на среде следующего состава (г/л): (ХН«) БΫ— 5,0; КНзР΄— 1,0; КС1 — 0,15; Мя50 7 НзΠ— 0,2; СаС1г — 0,05; дрожжевой автолизат — 50 мл; рН 6,0. Вода водопроводная. Каждый студент готовит 750 мл среды, разливает ее по 150 мл в 2 качалочные колбы (объем колбы 750 мл) и в 3 флакона (объем флакона 250 мл). Среды стерилизуют при 1 ати. Отдельно готовят необходимое количество 50%-го раствора глюкозы и сгерилизуют его при 0,5 ати. Перед посевом во все опытные сосуды вносят стерильный раствор глюкозы из расчета: 2 % (по массе) — для аэробного культивирования и 6 % (по массе) — для анаэробного культивирования.
Посевной материал в количестве 3 — 4 мл клеток (см. выше) добавляют в каждый сосуд для культивирования. Выращивание дрожжей в аэробных условиях (7-й вариант) проводят при интенсивной аэрации. Для этого колбы помещают на качалку (скорость вращения 180 — 200 об/мин).
299 Анаэробные условия (2-й вариант) обеспечиваются высоким слоем среды во флаконах и стационарными условиями культивирования. Для определения скорости брожения в одном флаконе ватную пробку заменяют стерильной резиновой пробкой с затвором, заполненным до половины Н,БО„. На верхний конец затвора необходимо надеть резиновый клапан. Затвор обеспечивает поглощение воды, испаряющейся из среды, и свободное выделение СОз образовавшейся при брожении. Продолжительность эксперимента 96 ч. Температура культивирования — 25— 30 'С. Периодически (раз в сутки) из культуральных сосудов (из колбы и Флакона без затвора) стерильно отбирают пробы для анализов, одновременно Флакон с затвором взвешивают.
Концентрацию дрожжей в культуральной среде определяют нефелометрически, используя кювету с длиной оптического пути 0,5 см и зеленый светофильтр )Чх 6 (Х = 540 нм). Для перехода от показаний ФЭК к количеству клеток строят калибровочную кривую зависимости между величиной светорассеяния и числом клеток в единице объема.
Для ее построения готовят 5 — 6 суспснзий дрожжей разной плигности. В этом случае можно воспользоваться оставшимся инокулятом либо сделать дополнительный смыв клеток со скошенного суслоагара. Оптическую плотность каждой суспензии измеряют па ФЭКе. Наиболее точные результаты получаются при работе с суспензиями, которые дают показания на средней шкале прибора — от 0,1 до 0,7 О. Затем в каждой суспензии подсчитывают число клеток дрожжей„пользуясь камерой Горяева. Результаты подсчета записывают в табл. 22.1.
Количество клеток дрожжей в 1 мл соответствующей суспензии вычисляют по формуле М= а 1000/й.з, где М вЂ” число клеток в 1 мл суспензии; а — среднее число клеток в квадрате сетки; Ь вЂ” глубина камеры (0,1 мм); х — площадь квадрата сетки (0,04 мм~); 1000 мм1 = 1 мл. Тогда количество клеток дрожжей в 1 мл суспензии = а 25 104. Полученные результаты (млн/мл) записьгвают в табл.
22.2. На основании данных табл. 22.2 строят калибровочную кривую, откладывая на оси абсцисс количество дрожжевых клеток, а на оси ординат — оптическую плотность соответствующей суспензии. Полученным графиком пользуются при определении числа клеток дрожжей в пробах, взятых из 1-го и 2-го вариантов опыта. Перед отбором проб содержимое сосудов необходимо пцательно взбалтывать для перевода клеток Таблица 22.1 Количество клеток дрожжей в квадратах счетной камеры 300 Т а б л и ц а 22. 2 Количество клеток дрожжей в суспензиях н соотвстствуквпис показания ФЭК Т а б л и ц а 22.3 Количество клеток дрожжей и удельная скорость роста в разных условиях культивирования для двух вариантов опыта во взвешенное состояние.
Следует подчеркнуть, что культуральную среду с высокой концентрацией клеток необходимо разводить, пользуясь стерильной средой из запасного 3-го флакона. Разведение учитывают при расчетах. Результаты вносят в табл. 22.3. Зная прирост биомассы в единицу времени, можно определить удельную скорость роста: р = 2,3Яаз — 1аа,)~1з — зн где р — удельная скорость роста; а, и аз — количество клеток в начале и конце промежутка времени соответственно (гз — 0); 2,3 — коэффициент перевода натуральных логарифмов в десятичные. Определение редуцирующих сахаров.
Для определения концентрации редуцирующих углеводов, в частности глюкозы, используют 2,3,5-трифенилтетразолийхлорид (ТТХ), которь|й восстанавливаясь глюкозой„превращается в окрашенный трифенилформазан. Последний, растворяясь в органических растворителях, окрашивает раствор в вишнево-красный цвет. К 2 мл раствора (культуральной среды), содержащего глюкозу, добавляют 1 мл бесцветного водного 0,3%-го раствора ТТХ и ! мл 2 н.
ХаОН. Смесь нагревают на кипящей водяной бане 3 мин, затем вынимают из бани, немелленно подкисляют 1 мл 2,1 н. раствора СНзСООН лля прекращения реакции. После охлаждения раствора объем жидкости доводят до 20 мл этанолом или изопропанолом. При этом развивается устойчивая окраска, интенсивность которой измеряют на ФЭК с зеленым светофильтром (1. = 485) в кювете с длиной оптического пути 3 мм.
Для перехода от показаний ФЭК к выражению количества глюкозы в еди- ницах массы строят калибровочную кривую, используя растворы, содержащие от 20 до 200 мкг глюкозы на 1 мл. 301 Определение глюкозы в культуральной среде проводят, как описано выше, предварительно освободив ее от клеток центрифугированием или фильтрованием, а также сделав соответствующие разведения при содержании ппокозы выше 200 мкг/мл.
Супернатант (фильтрат) до определения глюкозы можно сохранять в холодильнике в течение нескольких суток, прибавив к нему несколько капель толуола. Результаты определений вносят в табл. 22.4. На основании полученных данных об урожае дрожжей и количестве потребленной глюкозы рассчитывают экономический коэффициент в аэробных и анаэробных условиях: у = х/в, где х — количество клеток к моменту окончания опыта; в — количество использованной к концу опыта глюкозы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
