А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 86
Текст из файла (страница 86)
Из «рафика по периодическому культивированию рассчитывают параметры непрерывного культивирования и на основании полученных данных проводят непрерывное выращивание. 2. Измерение активности бактериахьиых ферментов. При определении активности бактериальных ферментов необходимо учитывать, что она должна быть изл«ерена в оптимальных условиях, ««еодинаковых для разных видов бактерий. Поэтому для определения активности ферментов каждой конкретной культуры ««еобходимо подбирать условия, которые включают оптимум рН, количество субстрата, внесенного в пробу, оптимум температуры для проведения реакции, наличие в биологической пробе возможных ингибиторов реакции.
Если активность фермента в экстракте клеток не проявляется, то это может быть следствием нескольких причин: 1) необходимо быть уверенным, что искомая активность вообще в клетках присутствует; 2) фермент может присутствовать в неактивной форме, и его активность проявится только лишь при добавлении активаторов; 3) если возможно, полезно провести позитивный контроль искомой реакции, добавив в реакционную смесь источник фермента с заведомо имеющейся активностью — такой контроль может указать на наличие в экстракте клеток ингибитора, мешающего определению искомой активности.
При определении активности ферме«пов в биологических источниках рекомендуется выражать скорость реакций в международных единицах. Для ферментов такой единицей является микромоль использованного субстрата (или образованного продукта) за минуту при 30 С. Специфическая активность препарата выражается в количестве международных единиц на 1 мг белка пробы. Ниже приведено описание метода определения оксидазной активности клеток, используемых в задаче. 3. Определение активностей НАДИ- и НАДФН-оксвдаз бактерий.
Работа проводится с двумя препаратами разрушенных с помощью ультразвука или пресса клеток. Для работы необходим регистрирующий спектрофотометр, способный измерять изменение оптической плотности при 340 или 365 нм, однако реакцию можно ««роводить, используя и обычный ФЭК при соответствующей длине волны.
Клетки отделяют от среды центрифугированием при 10 тыс. у, промывают 50 мМ К-фосфатного буфера, рН 7,5, и разрушают в том же буфере с помощью ультразвука при 22 кГц в течение 4 мин по! мин с перерывами для охлажления. Гомогенат центрифугируют при 40 тыс. я 25 мин и супернатант (экстракт) используют для определения ферментов. Готовят две пробы (если лля измерения активности используют ФЭК, то контроль готовят в двойном объеме), содержащие в 3 мл: К-фосфатного буфера (0,05 М, рН 7,5) — 2,5 мл; НАДН (или НАДФН) — 0,5 мкмоль; экстракта — 0,1 мл; воды дистиллированнои до 3 мл. В контрольную пробу вместо экстракта добавляют воду.
Реакцию начинают внесением экстракта и проводят в течение 3 — 5 мин. Необходимо выбирать такое количество экстракта (по белку), чтобы реакция за время измерения была линейной. Рассчитывают активность НАД(Ф)Н-оксидазы в мкмолях субстрата, окисленного в 1 мин, на ! мг белка экстракта, принимая, что коэффициент экстинкции НАД(Ф)Н при 340 нм равен 6,22 см/мкмоль. 4. Определение содержания АТФ в клетках бактерий.
Аденозинтрифосфат является важнейшим компонентом энергодающих и энерготранспорп«ых систем клетки, универсальным донором макроэргических фосфатных групп лля многих транспортных, биосинтетических и других процессов. В подавляющем болыпинстве в клетках микроорганизмов АТФ представляет собой основной макроэргический компонент, его содержание обычно превышает содержание других трифосфатов вместе взятых. Активности некоторых ключевых аллостерических биоэнергетических и биосинтетических ферментов регулируются в зависимости от энергетического заряда клети«ь Энергетический 296 заряд определяется суммой молярного содержания АТФ и половины молярного содержания ЛДФ клетки (так как 2 моля АДФ могут быть превращены в 1 моль АТФ с помощью аденилаткиназы), отнесенной к малярному содержанию всех аденилатов: энергетический заряд = (АТФ + 1/2АДФ)/(АТФ + ЛДФ + АМФ).
Из этого видно, насколько важно знать количество АТФ клетки для изучения некоторых аллостерических ферментов. Наиболее специфичны и удобны энзимологические методы определения количества АТФ в клетках микроорганизмов. В большинстве из них используются сопряженные системы из двух и более ферментативных реакций. Содержащийся в пробе АТФ в присутствии гексокиназы (ГК) фосфорилирует глюкозу; образующийся глюкозо-6-фосфат вступает в глюкозо-6-фосфатдегидрогеназную реакцию (Г-6-ФДГ): глюкоза ь АТФ вЂ” > глюкозо-6-фосфат + АДФ; глюкозо-6-фосфат е НАДФ" -+ 6-фосфоглюконовая кислота + НЛДФН з Н . Как видно из уравнений, количество прореагировавшего АТФ эквимолярно количеству НАДФН, образующемуся в результате глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной реакции; его количество определяют спектрофотометрически при длине волны 340 или 365 нм. Реахтивьс 6%-й раствор НС!04 (свежеприготовленный); 5 М раствор КзСОБ 60 мМ тризтаноламиновый буфер (рН 7,5); 0,1 М раствор МяС1,; 7,5 мМ раствор НЛДФ' (свежеприготовленный); 0,5 М раствор глюкозы; раствор гексокиназы (НФ 2.7.1.1)— 10 мг препарата кристаллической гексокиназы с активностью 10 ед/мг растворяют в 1 мл дистиллированной воды непосредственно перед определением; раствор глюкозо-6-фосфатдегидрогецазы (НФ !.1.1.49) — 40 ед.
фермента в 3,3 М растворе сульфата аммония растворяют в ! мл дистиллированной воды. Растворы ферментов готовят непосредственно перед употреблением и в течение эксперимента хранят их на льду. Ход олределеяия. Навеску клеток, разрушенных на прессе при замораживании (см. гл. 13), соответствующую 500 мг сырой биомассы, помегцают в центрифужную пробирку, куда предварительно наливают 1 мл 6%-й НС10х. Пробу перемешивают на льду 5 мин, добавляют холодную хлорную кислоту из расчета примерно '/з объема клеток и оставляют на 10 мин на льду для лучшей экстракции.
Осадок белка затем удаляют центрифугированием втечение 10 мип при 6 тыс. я (центрифуга ЦУМ- ! — 8 тыс. об/мин). Безбелковый экстракт переносят в другую центрифужную пробирку и удаляют избыток хлорной кислоты, добавляя 5 М раствора К,СО, из расчета 0,05 мл К,СО, на! мл кислого экстракта. Для более полного осаждения хлорного калия пробу оставляют на 10 мин во льду, а затем отделяют осадок цептрифугированнем при 5 тыс. я в течение 5 мин. Нейтрализованный экстракт клеток нагревают до комнатной температуры и немедленно используют для энзиматического анализа, поскольку при стоянии содержащийся в пробе АТФ гидролизуегся. Для проведения ферментативного анализа в кювету спектрофотометра (1 см) наливают 2,5 мл триэтаноламинового буфера, 0,05 мл раствора НЛДФ' и 0,35 мл раствора МяС1,. Добавляют 0,1 мл клеточного экстракта, перемешивают и через 3 мин после установления равновесия измеряют исходную величину оптической плотности (А,).
К пробе добавляют 0,05 мл раствора глюкозо-6-фосфатдепшрогеназы и через 5 мин измеряют оптическую плотность (А,). Нарастание оптической плотности пробы после добавления глюкозо-6-фосфатдепщрогеназы связано с окислением содержащегося в клеточном экстракте глюкозо-6-фосфата. В кювету вносят 0,4 мл раствора глюкозы и через 30 с измеряют оптическую плотность (Аз); небольшое уменьшение ее объясняется разбавлением пробы при добавлении раствора глюкозьь Добавляют 0,05 мл раствора гексокиназы и после окончания реакции (через !2 — 15 мин) записывают конечное показание спектрофотомегра (А4). Увеличение оптической плотности пробы после до- бавления гексокиназы связано с вовлечением в ферментативные реакции содержащегося в экстракте АТФ. Для учета изменений оптической плотности, вызванных добавлением ферментативных препаратов, в кювету дополнительно вносят по 0,05 мл препаратов глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы или гексокиназы и при расчете учитывают соответствующие поправки.
Количество АТФ в пробе (микромоль на 1 г сырых клеток) вычисляют по формуле Х= ГгА )' К/6,22, где АА — изменение оптической плотности пробы, вызванное использованием АТФ в сопряженной системе ферменгативных реакций (ЛА = ЛА4 — ЛАз); К вЂ” конечный объем пробы в кювете (3,5 мл); К— коэффициент разведения пробы по отношению к 1 г клеток, в данном случае равный 41,6; 6,22 — коэффициент микромолярной экстинкции восстановленной формы пиридиновых нуклеотидов при длине волны 340 нм и длине оптического пути 1 см. По разнице экстинкции аА = лА, — ЬА, можно аналогичным образом рассчитать содержание в пробе глюкозо-6-фосфата.
Данный метод специфичен и дает хорошо воспроизводимые результаты. Материалы, оборудование, иоеуда, реактивы Ферментер»Ультроферм 1601»; люминометр; пипепси на 1 мл — 25; на 2 мл — 15; пробирки с агаризованной средой для поддержания культуры — 10; ФЭК-56М; К-фосфатный буфер (рН 7,0, 0,1 М), реактивы гшя приготовления питателыюй среды, определения НАД(Ф)Н-оксидаз и количества АТФ (см, в тексте), дезинтегратор УЗДН-1, пресс для разрушения бактерий, центрифуги ЦУМ-1 и Вескгпап, спектрофотомегр. План выполнения задачи Для выполнения задачи необходимо 60 ч.
Занятие 1. Подготовка посуды и сред к стерилизации. Занятие 2. Посев культуры микроорганизма в колбы для получения посевного материала и периодического выращивания, отбор проб и определение биомассы по оптической плотности и свечения на специальной установке. Занятие 3. Отбор проб культуры из колб в процессе периодического выращивания бактерий, определение их оптической плотности и интенсивности свечения. Семинар. Занятие 4. Знакомство с устройством и принципом работы ферментера, подготовка его к стерилизации и стерилизация в автоклаве.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
