А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 85
Текст из файла (страница 85)
Микроорганизм растет в интервале температур от 10 до 28'С, при 30 С роста нет. Культуры хранят на среде, содержашей (г/л): пептона — 10; агара — 20; морской воды — 400 мл; мясной воды — 600 мл'„рН 7,4. Выращивание культур в колбах или ферментере ведут на жидкой среде следующего состава (г/л): дрожжевой экстракт — 0,5; )чаС1 — 30,0; На2НРО4 — 5,3; КН,РО4 — 2,1; 292 ()МН4)зНРО4 — 0,5; МВБО4 — 0,1; Ге504 7НзΠ— 0,001; понтон — 10,0; глицерин — 3,0; рН 7,4 до стерилизации. Среду стерилизуют при 0,5 ати 30 мин.
Для получения посевного материала К 7)зсЬегг' выращивают в течение 8 — 12 ч на качалке (200 об/мин) при 26'С в колбах на 750 мл с объемом среды 100 мл. Среду в колбах засевают смывом стерильной питательной средой клеток бактерии, выращенной на твердой питательной среде, из расчета одна пробирка со скошенным агаром на две колбы. Качество посевного материала считают хорошим, сели в темноте визуально определяется интенсивное свечение культуры.
В целях изучения кривых роста и интенсивности свечения бактерии выращивают в аналогичных условиях в течение 24 ч. Периодическое и непрерывное культивирование К гмс/гег( в ферментере проводят на жидкой среде, состав которой приведен выше. Устройство и принцип работы ферментера. Для обучения сгудснтов принципам проточного культивирования подходит любой ферментер, в котором при соблюдении стерильности проводимого процесса имеется возможность автоматически регулировать температуру, скорость перемешивания, количество подаваемого стерильного воздуха, значение рН и скорость подачи свежей среды.
Фермеитер «Ультроферм 1601» (ЕКВ, Швеция) представляет собой компактный настольный прибор (рис. 21.5), предназначенный для массового культивирования микроорганизмов в периодическом и непрерывном режиме, Прибор позволяет выращивать большое число различных видов микроорганизмов в строго контролируемых условиях.
Ферментер оборудован устройствами для поддержания и контролирования температуры, рН, скорости перемешивания и аэрации. Клетки культивируют в толстостенном стеклянном сосуде, выдерживающем автоклавировапие. Сосуд фиксируется на приборе с помощью двух направляющих рельсов и зажимов с винтами, позволяющими быстро отделять культиватор от стенда.
Для уменьшения возможности инфицирования ферментера посторонней микрофлорой мешалка связана с приводом мотора при по- моши двух постоянных магнитов. Лопасти мешалки обеспечивают эффективное перемешивание содержимого ферментера в радиальном направлении и могут быть легко приспособлены к любому уровню среды в сосуде. Постоянное перемешивание среды в ферментере достигается благодаря применению прецизионного мотора с калиброванным электрическим тахометром, позволяющим устанавливать скорость вращения мешалки от 1О до 2000 об/мин.
Контролирующий прибор погшерживает скорость вращения на заданном уровне, независимо от скачков напряжения в сети или вязкости культуры, цо типу обратнои связи. Стенд снабжен газометром, позволяющим учитывать и ре~улировать количество подаваемого в прибор воздуха или другого газа (СОм аргона). Регулирование температуры жидкости в ферментере осугцествяяется с помощью миниатюрною нагревателя и термодатчика, которые находятся в нижней части ферментера внутри сосуда.
Охлаждение ферменгера осуществляется водопроводной водой. Кислотность среды регулируется автоматически специальным прибором для контроля рН. Комбинированный электрод (измерительный и сравнения) перед стерилизацией монтируется на верхней крышке сосуда. Устройство электродов данною прибора позволяет стерилизовать их в автоклаве при давлении 1 ати, однако для других типов электродов может быть с успехом применена стерилизация спиртом. Перед каждой стерилизацией необходимо проверять уровень жидкости внутри электрода и при необходимости доливать свежий раствор электролита.
Регулирование рН осуществляется подачей щелочи или кислоты через два перистальтических насоса. Кислота и щелочь стерилизуются в сосудах с заранее подобранными силиконовыми шлангами, концы которых снабжены медицинскими иглами, завернутыми в бумагу или фолыу. Аналогично готовятся и стерилизукпся питательная среда и другие растворы, подающиеся в ферментер после его стерилизации.
293 Рис. 21.5. 1(ринпипиальная схема ферментера «Ультроферм 1601» (1,КВ, Швеция), работаюгцего в режиме непрерывного культивирования микроорганизмом 1 — подача магистрального воздуха через ротаметр; 3 — бактериальный фильтр для стерилизации поступаюгг[его воздуха; 3 — вход воздуха в фермеитер через мелкие отверстия; 4 — магнитная мешалка; 5 — обратный холслильиик для предотвращения испарения питательной среды; 6— бактериальный фильтр для улавливания клеток микроорганизмов в отхолящих газах; 7 — сосуд с дезраствором (5%-й раствор )ЧаНСОз) лля обеззараживзиия отхолявшх газов;  — шприц со стерильным пеногасителем; У вЂ” шариковый пробоотборник„10 — система нагрева питательной среды в фермеитере; 11 — отвол суспензии микроорганизмов через перистачьтическяй насос; 13 — сосуд лля сбора суспензии микроорганизмов; !3 — сосуд со стерильной питательной средой; 14 — подача стерильной питательной среды через перисгальтвческий насос; 15 — первстальтический насос; 16 — блок управления: поддержание значения рН среды (необходим датчик рН) темпсразуры, количества растворенного в среде Ог (веобходим датчик Ог), аэрации Крышка стеклянного сосуда фиксируется с помогцью шести винтов-чбарашковм К отверстиям входа и выхода воздуха присоединяют шланги с воздушными фильтрами, наполненными стерильной стеклянной ватой (воздух через фильтры должен проходить свободно).
Устройство прибора позволяет пользоваться для аэрации обычным магистралы)ым сжатым воздухом, который стерилизуется, проходя через фильтры со стеклянной ватой. Воздух, выходящий из ферментера„также автоматически стерилизуется через фильтр. Ферментер стерилизуют в вертикальном положении в автоклаве при давлении 1 ати от 30 до 45 мин в зависимости от объема среды в нем. По окончании стерилизации сосуд укрепляют на основном приборе, зажимают прижимными винтами и присоединяют к пульту управления с помощью специальных проводов датчики рН, кислорода, термодатчик, мешалку. При необходимости подводят охлаждающую воду. Питательную среду и другие растворы, включая посевной материал, подсоединяют к ферментеру с помощью медицинских игл, используя специальные отверстия, закрытые вакуумной резиной и находящи- еся на верхней крышке ферментера, строго соблюдая правила асептики (протирают отверстие спиртом до и после засева ферментера).
При достижении заданной температуры производят посев культуры. Закончив перемешивание засеянной культуры, из ферментера через выходной шланг отбирают пробу, где регистрируют начальную оптическую плотность клеток, значение рН и начальный уровень продукта (свечение). В дальнейшем пробы отбирают каждые 15 — 30 мин, измеряют названные параметры и строят график. После проведения периодического культивирования клеток в ферментере, а также построения графика роста и свечения культуры строят вспомогательный график для определения необходимых параметров непрерывного культивирования.
Задача вспомогательного графика — помочь установить параметры непрерывного процесса для получения максимального количества продукта (в нашем случае — свечения) при максимальной скорости роста н протока среды. Пример построения вспомогательного графика приведен в разделе «Графоаналитический метод расчета условий непрерывного культивирования микроорганизмов> (см. рис.
21.3). Графически вычислив параметры непрерывного культивирования„необходимые для проведения процесса с максимальной эффективностью, производят стерилизацию и очередной засев ферментера. По достижении необходимой плотности клеток (рассчитанной графически для максимального свечения) переводят процесс на непрерывный режим выращивания при соответсгвующей скорости разбавления, рассчитанной графоаналитическим методом. В дальнейшем через каждые 15 — 30 мин отбирают пробы, измеряют оптическую плотность культуры и уровень свечения клеток и убеждаются в том, что на протяжении 10 — 12 ч оптическая плотность клеток и уровень их свечения практически не изменяются и соответствуют максимальной производительности культуры при проточном культивировании.
Неболыпие изменения в концентрации клеток и свечении в ферментере объясняются в теоретическом разделе задачи. Методы анализов В процессе выращивания клеток в колбах и фсрментере студенты отбирают пробы, проводят измерения в них оптической плотности и биолюминесцентной активности (свечения) для построения кривой роста и кривой интенсивности свечения культуры от времени. Кривые строят, откладывая по оси ординат оптическую плотность (в единицах оптической плотности) по ФЭК-56М (фильтр )чо 6, длина волны 540 нм) или интенсивность свечения (в условных единицах), которую определяют с применением специального прибора, а по оси абсцисс — время культивирования в часах (на 24 ч роста).
1. Определение биолюминесцентиой активности бактерий. Клетки К Яьс!геп' имеют активную люминеспептную систему„испускающую кванты света в присутствии альлегида, юсстановленного флавина (ФМН) и кислорода. Для измерения интенсивности свечения клеток используют специальный прибор — люминометр Биотоке-6 (Россия). Суспензии К 7Ьсйегб взятые из колбы пли ферментера, разводят в !О, !00 или 1000 раз 0,1 М К-фосфатным буфером или 3%-м раствором ХаС! (рН 7,0) в зависимости от интенсивности свечения и концентрации клеток. Разведенную суспензню клеток вносят в кювету в количестве 1,0 мл, помещают кк1вету в гнездо кюветного отделе- 295 ния светонепроницаемой камеры и производят измерение интенсивности свечения. Результаты представляют в виде таблицы и графика. Результаты экспериментов по периодическому и проточному культивированию светящихся бактерий в управляемом процессе в ферментере представляют в виде соответствук«ших таблиц и графиков.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
