А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 88
Текст из файла (страница 88)
Определение скорости брожения. О скорости брожения я судят, во-первых, по количеству СОи выделившегося в единицу времени из определенного объема культуры, во-влгорых, по количеству этанола, образовавшегося за определенный интервал времени. Убыль С(Ч определяют, взвешивая периодически флакон с затвором. Для этой цели можно пользоваться техническими весами (взвешивают с точностью до 0,01 г). Рассчитывают, сколько углекислоты (г) выделилось из 1 л культуральной жидкости в ! ч за каждый промежуток времени межцу взвешиваниями флакона. Результаты записывают в табл.
22.5. Определение количества этанола химическим методом. Количество этанола, образовавшегося при брожении, опрсделякл оксицометрическнм методом, основанным на окислении этилового спирта до уксусной кислоты и воды смесью бихромата калия с серной кислотои: ЗСНзСНгОН + 2КзСг~Ог+ ЗНз504 = ЗСН,СООН + 2Сг(БОг)з + Кг504 + 11НгО Т а б л и ц а 22.4 Содержание глюкозы а культуральной среде а процессе роста дрожжей Т а б л и ц а 22. 5 Выделение СОг н процессе брожения, осуществляемого дрожжами 302 По окончании окисления спирта избыток бихромата оттитровывают раствором соли Мора: КзСгзОг + бГеЯО«()х(Н«)зВ04 + 7НзО = Сгз(БО«)з + Гез(БО«)з+ б()х(Н«)зВО«+ + 7НгО + КгВО« По количеству бихромата, израсходованного на окислсние, вычишиют концентрацию спирта.
Наиболее точные результаты метод дает при содержании спирта в жидкости в пределах 1 — 2 %. Поэтому при более высоких концентрациях спирта разбавляют культуральную жидкость, а при меньших — растворы соли Мора и бихромата. Ход ааализа. Культуральпую жнлкость в объеме 2 мл, освобожденную от клеток фильтрованием или центрифугированием, разводят дистиллированной водой в пять раз и переносят в круглодонную колбу на 50 — 75 мл.
В трехшариковый приемник наливают 25 мл раствора бихромата калия и 10 мл конц. НзВОе Колбу плотно закрывают резиновой пробкой с отводной трубкой, суженный конец коюрой должен доходить почти до дна приемника. Защм в течение 1Π— 15 мин оттеняют '/з содержимого колбы. Раствор бихромата за это время меняет окраску от оранжевой до грязно-бурой. После озтонки во избежание перебрасывания жидкости из приемника убирают отводную трубку и только потом отставляют горелку.
Содержимое приемника переносят в мерную колбу на 100 мл. Дистиллированной водой споласкивают приемник и отводную трубку, промывные воды выливают в ту же мерную колбу. После этого раствор доводят до метки дистиллированной водой, перемецгивают, отбирают нз него 20 мл в коническую колбу на 250 мл, добавляют 1О мл дистиллированной воды и титруют солью Мора. Параллельно ведут контрольное титрование, чтобы определить количество соли Мора, идущее на титрованне 5 мл раствора бихромата.
Для этого в коническую колбу помещают 5 мл раствора бихромата, 2 мл конц. Н,БОо 20 — 30 мл дистиллированной воды и титруют солью Мора. Соль Мора— нестойкое соединение, поэтому контрольное титрование обязательно делают при каждом определении. Конец титрования устанавливают капельной пробой с феррицианидом (К,Ге(СЬ1)«).
Для этого на чистую белую фарфоровую или керамическую пластинку стеклянной палочкой наносят каплю тичруемой жидкости и рядом из капельницы— кюшю раствора феррицианида. Интенсивное синее окрашивание, получаемое при слиянии капель, указывает на конец реакции. Опытный н контрольный растворы титруют по два раза. Первое титрование служит для получения ориентировочных результатов, поэтому реакцию тнтруемой жидкости с раствором феррицианида проводят после добавления каждого миллилитра раствора соли Мора, которое было определено первым титрованием, а затем делают качественную реакцию каждый раз после добавления О,1 мл раствора соли Мора.
Количество этанола Х (в г/10 мл культуральной среды) рассчитывают по формуле Х= [(и — 6).25 5а]0,01, где а, б — количество соли Мора, пошедшее на титрование соответственно контрольного и опытного вариантов, мл; 25 — количество КзСг20ь мл. Полученные результаты представляют в виде табл. 22.6. Определение количества этапола фермевтатвввым методом с помощью набора реактивов «Фотоэтавол». Определение этанола основано на реакции, катализируемой адкогольоксидазои: этанол + Оз -» еиетальдегид + Н,О, Образующаяся в ходе данной реакции перекись водорода окисляет субстрат цероксидазы с образованием окрашенного продукта.
С помощью ланного метода можно определить от 1 до 80% этанола в среде. 303 Таблица 22.6 Образование этанола ирн роете дрожжей в анаэробных условиях Ферменты для определения этанола выпускаются в виде специального набора «Фопюэтанол» («Импакт. Москва, Россия), которгяй включает три реагента. Реаггнт 1 — фосфатный буфер (рН 7,0), субстрат пероксидазы; перед использованием содержимое флакона растворяют в 100 мл дистиллированной воды; раствор стабилен при хранении в темном флаконе при температуре 2 — 6 С в течение 48 ч. Ргагешл 2 — калибровочный раствор этанола. Ргагевт 3 — лиофильно-высушенный порошок, содержащий фермент алкогольоксидазу и его стабилизаторы; стабилен при 2 — 6 С в течение 3 мес. Рабочий реактив готовят добавлением к реагенту 1 содержимого флакона 3 и 1 мг пероксидазы.
Рабочий реактив стабилен при 2 — 6 С в темноте не дольше 48 ч. Для анализа культуральную жидкость разбавляют водой в 20 раз, тщательно перемешивают, отбирают из них аликвоты объемом 20 мкл и вносят в пробирки, содержащие 2 мл рабочего реагента. Параллельно в одну пробирку вносят 20 мкл калибровочного 1%-го раствора этанола, предварительно разбавленного, как и исследуемые пробы. Оптическую плотность реакционной смеси измеряют через 30 мин инкубации при комнатной температуре.
Измерение проводят на ФЗК при длине волны 470 — 540 нлг относительно рабочего реактива, в который вносят 0,04 мл дистиллированной воды, в кювете с длиной оптического пути 1О мм. Концентрацию этанола рассчитывают по формуле С=(Е,/Е ) С 1%, где ń— оптическая плотность в кювете с образцом, измеренная относительно холостой пробы; Š— оптическая плотность в кювете со стандартом; С вЂ” концентрация этанола в стандартном растворе. Опредслеяне этилового спирта методом газожидкостной хроматографии.
Определение этилового спирта можно проводить на хроматографе с колонкой, содержащей неподвижную фазу полиэтиленгликольадипината, нанесенного на хромосорб йг, и пламенпо-ионизационным детектором. Ход анализа. В одноразовую пластиковую пробирку вносят 100 — 200 мкл образца. К пробе приливают 1 мл дистиллированной воды и гомогенизируют смесь путем энергичного встряхивания. Пробирку с гомогенной смесью центрифугируют 1О лгин при 7000 об/мин. Пол>ченный таким образом препарат должен быль прозрачным. Хроматографирование и обработку результатов проводят так же, как при определении ЛЖК (см.
гл. 33). Для расчета концентрации используется метод внутреннего стандарта, который состоит в добавлении к определенной массе исследуемого материала этанола с известной массой и известной площадью пика. Для более точного и быстрого расчета концентрации по площадям пиков следует использовать компьютерную программу «ЗКОХРОМ» (разработка ИОХ, Россия). 304 Недостатком данной методики является определение суммарной фракции этилового и метилового спирта в образцах.
Однако в связи с тем, что культуральная жидкость Яассйаготуеее с«геле!ае метанола не содержит, описанный выше метод в атой работе может быть использован для определения зтанола. Определение интенсивности дыхания клеток. Дьгхание дрожжей (поглощение клетками молекулярного кислорода) определяют полярографическим методом. Около 100 мг сырой дрожжевой биомассы ресуспендируют в 5 мл фосфатного буфера (0,05 М; рН 7,0), встряхивая пробирку.
Суспензию в количестве 2,5 мл вводят шприцем в ячейку полярографа. При заполнении ячейку наклоняют таким образом, чтобы воздух полностью вытеснялся из камеры через верхний ппуцер. Кинетику поглощения 01 записывают в течение 1 — 2 мин. Прописывается кривая, соответствующая эндогенному дыханию. Затем в ячейку добавляют 0,1 мл раствора глюкозы ло конечной концентрации 10-' М и измеряют скорость поглощения кислорода. Для получения окончательного результата из найденной величины скорости дыхания вычитают величину скорости эндогенного дыхания.
Результаты вносят в табл. 22.7 Изучение морфологии и цитологии дрожжей. Каждую пробу первого и второго вариантов опыта микроскопируют„определяя размеры дрожжевых клеток и наличие в них гликогена, а также подсчитывают процент живых и почкующихся клеток. Размеры дрожжевых клеток определяют в препарате «раздавленная капля с обьективом 40х, используя винтовой окулярный микрометр. Измеряют не менее 30 клеток и средние величины записывают в табл. 22.8. Гликоген может накапливаться в цитоплазме дрожжей в виде гранул. При обработке клеток раствором Люголя он приобретает красно-коричневый цвет.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
