А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 92
Текст из файла (страница 92)
В этом случае образующаяся в клетках перекись водорода выступает окислителем сероводорода и восстанавливается до воды. К серобактериям относят микроорганизмы различного происхождения: нитчатые скользящие серобактерви родов Веял!шоа, ТМоглпх, Лпор!оса, Т!яшр!г!!!ит и др., серо- бактерии с гигантскими одиночными клетками (АсЬготадвль Ь(асголюлаз и Т!погиб ат) и опюснтельно мелкие формы (ТЬюзр!га и ТЬ!оЬас!епит). Лишь немногис штаммы соробактерий удается выращивать в вице чистых культур на минеральной среде с сероводородом. Чаще онн требуют присутствия небольших количеств органических вещесшс Таким образом, среди серобактерий имеются хемолитоавтотрофныс и хемолитогегеротрофные вилы.
В отличие от серобактерий, ~рупца тионовых бактерий изучена лучше. Зги формы при окислении сероводорода не откладывают серу. внутри клеток, большинство из ннх— хемолитоавтотрофы. Они предаташиют собой единую в морфологическом и биохимическом отношении группу организмов. Все тноновые бактерии, за исключением небольшого числа денитрифнцируюшпх видов, — аэробы и способны использовать энергию окисления восстановленных соединений серы в серную кислоту лля ассимиляции углерода, образования веществ клетки и для других Функций. Некоторые тионовые бактерии способны кроме окисления серы использовать для своей жизнедеятельности окисление других соединений, например органических вешесгв или закисного железа.
Морфологически тионовые бактерии представляют собой мелкие палочки с округлыми концами и одним полярным жгутиком, этим они напоминают типичные псевдомонады. Различают группу автотрофных тиобацилл, развивающихся в кислой среде (например, Ас!г!!гЬ!оЬас!!!т !Ь!оохЫалз), окисляюших ионы железа (А. ТеггоохЫилз), развивающихся в нейтральной среде (ТЬгоЬас!!!их !Ь!ерапи) и денитрифицирующих (т.
Аеас!плсалз). к этой группе относятся основные виды тиобацнлл. существуют также гетеротрофные тиобациллы, развивающиеся в нейтральной или щелочной среде (Т. логе!!цг). Конечным продуктом окисления серы у всех тионовых бактерий является сульфат. Ниже приведена схема окисления тиосульфата у различных тиобацилл, подтвержденная экспериментальными данными. По этой схеме тиосульфат либо превращается в тетратионат под действием тиосульфатокисляюшего Фермента (1), либо расщепляется на серу и сульфит при участии тиосульфатрасшепляюшего фермента — роданезы (2), 315 По-видимому, при низкой концентрации сульфата идет прямое расще~пение, а при высоком его соб 8 8 8 держании — образование тетратяоната.
Под лействием неизученного фермента (3) тетратнонат гидро- 2- О 2- -э '-' + 8Оз лизуется с восстановлением в тиосульфат, серу и 4 ~ ~ б+-АМФ сульфит. Окисление серы ведет к образованию суль- 80 + АФС 3 + фита, но ис тиосульфата. Реакцию осугцсстщиет сероокисляющий фермент (4), который„возможно, является оксигеназой. Окисление сульфата может БО~ — э АДФ осуществляться сульфитоксидазой (сульфитцитохром с-оксидоредуктазой (5) или проходит с участием АМФ, аденилилсульфатредуктазы (б), АДФ-сульфурилазы (7) и идет с субстратным фосфорилированием.
Акцептором электрона сульфатрелуктазы может быть цито- хром с, окисление которого, по-видимому, связано с окислительным фосфорилироаанием, однако неизвестно, какое количество АТФ синтезируется в результате потери атомом серы 8е при окислении сульфида до сульфата. Ферментная система, окисляющая сульфид до элементарной серы, неизвестна (8). Однако лсгко можно наблюдать быстрое внутриклеточное образование элементарной серы хсмолитотрофами, использующими сероводород. еь'Ф юййы~: у~~ Р~ ~ Ф роокисляющих и тионовых бактерий, а также процессом образования клетками сульфатов прн развитии на средах с восстановленными соединениями серы. Ход выпопнения задачи Микроорганизмы и их культивирование. Работу проводят с представителями бесцветных серобактерий Ве887агоа зр., Масютоиаз зр.
и ТЬниргга зр., а также тионовыми бактериями 7Жобас/1)из Я|орагаз, А. гИоохЫа~и, А./еп-оохГг)ат. Штаммы тноновых бактерий, используемые в задаче, получают энергию в результате окисления минеральных восстановленных соединений серы или свободной серы, при этом сера в качестве промежуточного продукта окисления откладывается вне клеток. Акцептором электронов служит молекулярный кислород. Для Т. г)яорагиз готовят 500 мл среды следующего состава (г/л): НН4С1— 0,1; ХазНР04 2НзΠ— 0,2; М8С1з 6НзΠ— О,1; вода водопроводная — 800 мл.
Среду стерилнзуют при 0,5 ати 30 мнн. После стерилизации в среду стерильно вносят 100 мл 5%-го раствора НазБзО, 5НзО и 100 мл 1%-го раствора 'МаНСОз в дистиллированной воде„доводят рН до 8 — 8,5 с помощью стерильных 10%-х растворов 1заНСОз нли НС1. Агаризаваняая среда для Т. Я|орагиз имеет следукпций состав (г/л): НазБзОз 5НзΠ— 5,0; КзНР04 — 0,1; НН4С1 — 0,1; ХаНСОз — 0„2; агар — 20,0; вода водопроводная — 1 л. До стерилизации в среду добавляют избыток СаСОз.
После стерилизации при 1 ати 30 мин доводят рН до 8 — 8,5 н разливают среду в стерильные чашки Петри. Сос1ав среды для А йюохк(ащ (г/л): (ЖН4~804 — 02; КНзРО, — 30; М8804. Л1зО— 0,5; СаС!з 6НзΠ— 0,25; Ре804. 7НзΠ— следы; 8' (порошок) — 10,0; вода дистиллированная — 1 л. Готовят 500 мл среды, разливают по 100 мл в качалочные колбы на 750 мл, стерилизуют 30 мин при 0,5 ати, после стерилизации доводят рН до 4,0 с помощью стерильного 10%-го раствора НзР04. 316 А. ~егтоохЫапз культивируют в той же среде, значение рН которой доводят перед посевом до 3,5 стергпьным 10%-м раствором. В процессе выращивания отбирают пробы культур А.
7/г|оохЫапз, Т. 7/ггорпгиз .г А. /еггоохЫапх через 2, 3 и 5 сут культивирования. Микроскопироваиие. Готовят препарат «раздавленная капля» и просматривают его в микроскопе с фазово-контрастным устройством. Визуально фиксируют наличие капель серы в колониях Т. 77ггорагъх при росте на чашках Петри с агаризованной средой и зарисовывают их в отраженном свете. Из культур бесцветных серобактсрий, отооранных из пробирок, готовят препарат «раздавленная капля». В микроскопе с фазово-контрастным устройством наблюдают за скользящим движением 7)еяхгагоа зр., ее морфологией, отложением капель серы в клетках, морфологией крупных палочковидных подвижных клеток Масгогяеаах зр.
с полярно расположенным жгутиком и 77ггозргги зр., спирилл с винтообразным движением (культуры предоставляет препоза ватель). В течение 30 — 60 мин наблюдают за образованием и накоплением серы внутри клеток Т7гюариа зр. при инкубации их в среде с полисульфилом. Для этого каплю суспензии клеток 77гглх/ггга зр., отделенных от культуральной жидкости центрифугированием (3 тыс. д, !О мин), помешают на предметное стекло, добавляют каплю полисульфида (1О г 1чагЯ 9Н,О + 3 г Я' + 15 мл НгО), закрывают покровным стеклом и рассматривают под микроскопом с обьективом 40х.
Наблюдение можно проводить в поляризованном свете микроскопа. Определение биомассы и рН. За развитием культур следят по накоплению биомассы, изменению рН, помутнению среды (за счет выделения серы клетками тиобацилл). Биомассу определяют на примере Т. 77гго)гипа. Предварительно избавляются от выделившейся в среду серы путем центрифугирования 5 мл культуральной жидкости, отобранной из каждой колбы, при 2 тыс. я на настольной центрифуге в течение 2 мин.
После осаждения серы оптическую плотность супернатанта измеряют в кювете с длиной оптического пути 0,5 см (когпролем служит вода). Об изменении кислотности серы судят по измерению рН культуральной жидкости потенциометрически после определения в ней биомассы на нефелометре. Определение количества образованного сульфата. В динамике развития культур А. 17ггоохггуаяз, Т. г(ггорапи и А. Хепоохгт(аяз определяют количество сульфатов, образованных при окислении тиосульфата и элементарной серы. В основе метода лежит свойство сульфатов образовывать нерастворимую в воде соль ВаЯО«, оптическую плотность суспснзии которой определяют нефеломстрически и по стагщартной кривой пересчитывают на содергхание сульфатов в определяемом растворе.
Ход определения. К 0,2 мл опытного образца (культуральная жидкость после отделения клеток и серы центрифугированием при 3 тыс. я, 15 мин), содержащего ионы ВО«, прибавляют 3,3 мл 4%-й трихлоруксусной кислоты и 1 мл раствора ВаС1,-желатин. Смесь тщательно перемешивают и через 10 — 15 мин величину рассеивания измеряют на ФЭК-56 при длине волны 560 нм (светофильтр )х» 6) в кювете с длиной оптического пути 0,5 см. Чувствительность метода — 100 мкг/мл. Стандартную кривую строят по ЙагВО4 или МВБО, 2НгО при концентрациях сульфата 100, 500, 1500 и 2000 мкг/мл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
