А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 106
Текст из файла (страница 106)
Для медицинских целей препараты витамина Вц получают нз пропноново-кнсльгх бактерий. В сельском хозяйстве используют препарат, приготовленный на основе биомассы метаногенов. 362 В настоящее время в медицине, фармацевтической и пищевой промышленности широко применяют наряду с химическими также микробиологические методы определения различных витаминов. Как правило, химические методы определения витаминов трудоемки и требузот довольно большого количества исследуемого материала. Микробиологические методы обладают большой точностью и позволяют определить содержание витаминов практически в любом биологическом материале.
Ниже приводятся задачи, знакомящие студентов с микробиологическими метолами определения витамина Ви, никотиновой кислоты (витамина РР, нли В,) и ипозита (витамина В,). ЗЬ««нйю«: »» л»» "" """ ь "» кислых бактерий тремя различными способами: 1) методом диффузии в агар; 2) пробирочным методом; 3) спектрофотометрическим методом. 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА ВИТАМИНА В„, МЕТОДОМ ДИФФУЗИИ В АГАР Ход выполнения задачи Микроорганизм и его культивирование.
Для проведения анализов необходимо 10 — 15 мл культуры Ргор(отЬас!епит/генг)енге!сй!й Состав и приготовление среды, подготовка посевного материала для культивирования и поддержания пропионовокислых бактерий описаны в задаче «Пропионовокислое брожение» (гл. 23), которую можно по времени совместить с настоящей задачей. По окончании культивирования биомассу пропионовокислых бактерий определяют нефелометрически. Пропионовокислые бактерии можно хранить в холодильпике в виде живой культуры 14 — 20 сут или в виде отделенной от культуральной жидкости биомассы в морозильной камере более месяца.
Метод основан па опрелелении интенсивности роста тест-организма, мутантного штамма Езсйег!сй!а сей 113-3, требующего витамин Вп, на агаризованной среде вокруг лунок, в которые внесен определенный объем экстракта витамина Вп полученного из культуры пропионовокислых бактерий. Развитие тест-организма (в мм зон роста) зависит от количества витамина Вп в экстракте. Подготовка тест-оргяиизма.
Культуру Е. сой 113-3 поддерживают на среле следующего состава (г/л): гидролизат казвина — б,0; К,НРО« — 0,2; РеЯО« — 0,005; Май« вЂ” 0,2; л1;аспарагин — 0,2 (растворяют в 0,1 н НС1); глицерин — 2,0; витамин Ви — 100 мкг; агар — 15,0; вода дистиллированная; рН среды 6,8 — 7,0. Среду стерилизуют при 0,5 ати. Перел определением витамина Вп Е.сой !13-3 пересевают на «голодную среду», содержашую (в г/л): пелтон — 5,0; )л!аС! — 5,0; агар — 1,5; вода водопроводная; рН среды 7,0. Среду стерилизуют при 1 ати. Е.еой культивируют при 37 С в течение суток.
Экстракция витамина Вп. Витамин Вп извлекают из клеток пропионовокислых бактерий в кислой среде при нагревании. Чтобы витамин В и не разрушился, еп> стабилизируют нитритом натрия (или цианистым калием или натрием). Для этого к 1 мл культуры в градуированной пробирке добавляют 3 — 4 мл дистиллированной волы, перемешивают и полкисляют 0,1 н.
раствором НС1 ло рН 4 — 5 (по метилрог-оранжево-красная окраска). Пробы отбирают капилляром или стеклянной палочкой. Затем в пробирку вносят 2 мл 0,1%-го раствора 1«а)ЧО, и нагревают в кипяшей водяной бане в течение 15 — 20 мин. После чего осторожно ловолят РН раствора ло 7,0 сухой содой по бромтимолблау или с полюшью рН-метра. Содержимое пробирки доводят ло 10 мл дистиллированной водой и используют для определения витамина. Определение витамина В» методом диффузии в агар. Готовят 250 мл среды следующего состава (г/л): глюкоза — 10,0; лактоза — 3,0; лимоннокислый натрий трсхзамещенньгй — 3,0; !ЧН«С! — 3,0; К,НРО« — 0,4; !ЧаС1 — 3,0; агар — 20,0; вода листиллированная; рН срелы 7,0. Среду стерилизуют при 0,5 ати в колбе на 500 — 700 мл.
В пробирку с олносуточной культурой тест-организма Е. сой 113-3 на «голодной среде приливают 5 мл стерильной дистиллированной воды. Полученную суспензию в количестве 1 — 2 мл (суспензия не должно бьонь очень гуолой!) вносят в предварительно расплавленную и охлажденную ло 45 С среду. Срслу, инокулированную Е сой 113-3, тщательно перемешивают и сразу же выливают на лно лотка размером 35 х 30 см. Борта лотка сделаны из 363 нержавеющей стали, алюминия или дерева, а дном и крышкой служат стеклянные пластины. Лоток предварительно стерилизуют спиртом и обжигают пламенем горелки. Среда должна завыть ровным слоем, поэтому лотки помещают па строго горизонтальную поверхность (по уровню). После того как агар застынет, лоток ставят на трафарет и пробочным сверлом (диаметр около 8 мм), простерилизованным спиртом и пламенем, вырезают в среде лунки.
Расстояние между лунками 5 — 8 см. В один ряд лунок закапывают стандартные растворы витамина Вп, а в другой — экстракт витамина В„из пропионовокислых бактерий. Стандартные растворы витамина Вп готовят из стерильного раствора определенной концентрации (аптечный препарат), находящегося в ампуле (концентрация витамина в ! мл отмечена на ампуле). Исходный раствор витамина Вп должен содержать 0,2 мкг/мл.
Для приготовления такого раствора ампулу осторожно вскрывают, необходимое количество раствора витамина переносят в чистую мернук~ колбу и растворяют в дистиллированной воле. Из этого раствора готовят ряд разведений, содержащих витамин Вп в концентрациях 0,05; 0,025; 0,0125 и 0,000125 мкг/мл. Все приготовленные стандартные растворы витамина (включая и исходный) закапывают в 10 лунок. Каждый раствор вносят в две лунки. Экстракт витамина Вп из пропионовых бактерий закапывают в две лунки без развеления, в две лунки с разведением в 2 раза и в лве лунки — с развелением в 4 раза.
В каждую лунку вносят 50 мкл раствора или экстракзв. Стандартные и опытныс растворы закапывают в лунки на одном лотке, который затем выдерживают 2 ч при комнатной температуре для диффузии витамина Вп в агар, а потом помешают в термостат на 37 С. Диаметр зон роста Е. со!( 113-3 вокруг лунок измеряют через сутки после внесения витамина.
На основании данных со стандартными растворами вычерчивают, пользуясь специальной полулогарифмической шкалой, график зависимости роста Е. сой от количества витамина. По результатам, полученным с опытными растворами, определяют, пользуясь стандартной прямой, количество витамина В и в исследуемом экстракте пропионовокислых бактерий и пересчитывают сго на 1 мл и на ! л культуры, а также на ! г абсолютно сухой биомассы (АСЬ).
При этом учитывают, что при приготовлении экстракта культуру разводили в 10 раз, а также все последующие разведения. Для построения стандартной кривой и определения витамина используют средние результаты двух повторностей. Полученные данные о содержании витамина Вп в биомассе пропионовокислых бактерий вносят в табл.
31.3. Материалы, оборудовииие, посуда, реактивы Пробирки — 10; пипетки на 1 — 2 мл — 5; колба на 500 мл; цилиндр мерный; лоток для определения витамина методом диффузии в агар; баня водяная; штатив лля пробирок; пробочнос сверло; трафарет, расчерченный на квадраты; !ЧаХОВ полулогарифмическая миллиметровая бумага; раствор витамина Вп в ампуле; реактивы для приготовления орел. Таблица 31.3 Количество витамина Вп, образованное пропионовокислыми бактериями План выполнения задачи Для выполнения задачи необходимо 18 — 20 ч. Занятие !.
Приготовление и стерилизация среды лля определения витамина Вп с помощью Е, со!! 113-3. Подготовка «голодной среды» для Е. со!! 113-3. Пересев тест- культуры Е. со!! 113-3 па «голодную среду» за сутки до занятия 2. Занятие 2. Определение витамина Ви методом диффузии в агар, Занятие 3. Оформление результатов задачи. Зачет. 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА ВИТАМИНА В,з ПРОБИРОЧНЫМ МЕТОДОМ Ход аыпопнения задачи Микроорганизмы и их культивирование. Для проведения анализов необходимо 10 — 15 мл культуры Р./геиг(епге!сЬ!Е Через 48 ч после внесения посевного материала в растущу!о культуру Р. /геиг(епге/с!гш' вносят предшественник синтеза витамина Вы — 5,6-диметилбензимидазол (5,6-ДМБ) в количестве 2 мг/л и культивирование продолжают еще 48 ч.
Исходный раствор 5,6-ДМБ готовят на дистиллированной воде, подкисленной НС1. По окончании культивирования биомассу пропионовокислых бактерий определяют нефелометрически. Тест-культуру Е. соД!!3-3 поддерживают, как описано выше. Метод основан на определении интенсивности роста в жидкой среде в пробирках мутанта Е. со!! 113-3, требующего для роста витамин Вп. Чувствительность метола— 0,002 — 0,004 мкг витамина в образце. В качестве опытной испачьзуют среду следующего состава (г/л): КзН РО4 — 7,0; КНзРО4— 3„0; натрий лимоннокислый — 0,5; М88О«.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
