А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 115
Текст из файла (страница 115)
(готовится заранее лаборантом). План проведения задачи Занятие 1. Подготовка и стерилизация посуды и сред (4 ч). Посев бактерий на скошеннь>й БСА и их выращивание (24 ч). Занятие 2. Приготовление суспснзии клеток бактерий и ее стандартизация до конпентрации 10» (по стандарту мутности). Приготовление разведений и посев бактерий на чашки с БСА и жидкие минеральные срелы в широких пробирках и колбах (4 ч). Инкубация посевов в разных условиях (24, 48 и 72 ч). Занятие 3. Описание культуральных свойств вариантов культуры псевдомонад на жидких средах. Определение оптической плотности и рН культуральной жидкости усредненной пробы каждого варианта.
Приготовление разведений усредненных проб из разных вариантов жидких сред и посев бактерий на чашки с БСА (4 ч). Инкубация посевов (48 ч). Занятие 4. Подсчет колоний, выросших на чаппсах с БСА. Определение доли диссоциантов в разных вариантах опыта. Оформление результатов.
Закладка на хранение чашек с М-диссоциантом при комнатной температуре (4 ч). Хранение чашек с М-диссоциантом до подсыхания (1 мес). Занятие 5. Приготовление десятичных разведений из колонии М-лиссоцианта и посев бактерий на чашки с БСА (2 ч). Инкубация посевов (48 ч).
Занятие б. Подсчет колоний, выросших на БСА, и определение доли днссоциантов. Оформление результатов (4 ч). Глава 35 ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ Наследственность обеспечивает материальную и функциональную преемственность между поколениями организмов. Наследственная информация„необходимая для существования и воспроизведения организмов, заключена в селах, которые обладшот тремя основными свойствами: они выполняют специфическую функцию, способны к точному самовоспроизведению, чрезвычайно стабильны. Гены расположены в линейном порядке на храаосол>ах, причем кажлый ген занимает свое собственное место, илн лакус. Таким образом, основной структурой„обеспечивающей материальную основу наследственности, является хромосома — система линейно сцепленных генов, обеспечивающих хранение и передачу информации.
Прокариоты и эукариоты различаются генетической организацией. У эукариот наследственная информация находится в хромосомах, расположенных в ядре. Экстрахромосомальная ДНК у эукариот может быть представлена >ыазмидали, митохондриаль- 392 ной ДНК, хлоропластной ДНК. Генетический аппарат прокариот представлен у большинства групп прокариот одной кольцевой молекулой ДНК. В определенных условиях в клетке может находиться несколько копий бактериальной хромосомы.
ДНК содержится также во внехромосомных генетических элементах плазмидах, в большинстве случаев кольцевых, автономно рсплицирующихся небольших молекулах. Совокупность всех генов организма называют генаниаюм, а совокупность присунгих организму признаков — о)енатинам. Спецификой генетических исследований микроорпшизмов является изучение свойств нс отделыюй особи (клстки), а популяции в целом (микробной культуры). Изменчивость организмов может быть наследственной и ненаследственнай. Нснасдедствснная изменчивость (модификационная, фенотипичсская) является адаптивной, приспособительной к изменению факторов внешней среды, однако она гспстичсски детерминирована н находится в пределах нормы реакции организма. Таким образом, Фсноти~~ микроорганизма часто в значительной степени определяется условиями его выращивания. При изменении внешних условий большинство клеток в популяции претерпевает изменения приспособитсльного характера, вызванные регуляцией клеточного метаболизма.
Наслсдспенная изменчивость подразделяется на комйинативнут и мутациага~угв. В первом случае изменения обусловлены генетической рскомбинацией, т.с. псрекомбинацисй уже имеющихся генов, участков хромосом и хромосом, несущих разные аллсли. Комбинативная изменчивость определяет разнообразие потомков, получивших новые комбинации генов и хромосом, существовавших у родительских Форм. В значительной степени этн явления присущи организмам, имеющим половой процесс. Несмотря на стабильность, гены обладают способностью подвергаться случайным внезапным изменениям, или мутациям, в результате чего появляются новые аллели, функционально отличныс от исходного гена.
Таким образом, мутационнан изменчивость — зто возникновение новых дискретных единиц генетического материала, прежде всего новых аллелей. Основные понятия генетики микроорганизмов Каждый вид микроорганизма может быть представлен ридом штаммов. В генетике микроорганизмов термином лшталою обозначают генетически однородную культуру определенного вида, выделенную из одной клетки и отличающуюся от других штаммов происхождением, а часто и рядом признаков, несущественных для систслштики. Штамм, выделенный из природного источника, называют диким глино»с Один из основных методов генетического анализа микроорганизмов — метод «ланирования культуры.
Клон — это генетически однородное потомство, полученное при размножении одной клетки (у прокариот) или вирусной частицы. У эукариотичсских микроорганизмов клон — потомство одной клетки (споры), делящейся митотически. Получение оздсльных клонов позволяет изучать свойства гснстичсски однородной совокупности клеток (популяции). На практике клоны получают из отдельных колоний микроорганизмов, выросших на поверхности плотной питательной среды из отдельных клеток (принцип *одна клетка — одна колония»). Признаки микробных культур можно подразделить на морфологические, физиологические и биохимичсские. Наследственной основой всех проявляемых признаков определенного штамма (фенотипа) служит его наследуемая генетическая организация (генотип).
Перед проведением генетических экспериментов необходимо убедиться в чистоте штаммов, отклонировать их, вырастить в небольшом объеме среды и соответствующим образом проверить их генотип. На практических занятиях по генетике микроорганизмов наиболее широко используемыми объектами из бактерий являются Елене«1сн(а со!1 и !)ас1!1ив вибйт1«, а из эукариот — некоторые виды грибов. Однако это не исключает 393 использование и лругих генетически хорошо изученных микроорганизмов. В данном практическом руководстве рассматриваемые методики относятся главным образом к Е. соб. Мутйгенез Мутации являются первоисточником наследственной изменчивости и наряду с генетической рекомбинацией поставляют материал для эволюции, а также искусственного отбора. Они представляют собой ценный инструмент в генетических и биохимических исследованиях: 1) вызывая изменения в гене, а следовательно, и в фенотипе, мутации служат генетическими маркерами, позволяющими не только идентифицировать ген, но также локализовать его на хромосоме, плазмиде или другой молекуле ДНК в клетке с помощью методов генетического картирования; 2) наличие набора мутаций помогает исследовать процессы метаболизма и механизмы их генетического контроля; 3) исследование белков, измененных в результате мутаций, способствует установлению их структуры и функционирования; 4) мутации являются основой для селекции штаммов микроорганизмов с полезными свойствами (например, штаммовпродуцентов антибиотиков).
По своему происхождению мутации могут быть слонтанными и нндуцнрованными. Спонтанные мутации возникают в естественных условиях в результате нормальных процессов в клетке или при взаимодействии клеток с окружакнцей средой. Мутагенным действием обладают неконтролнруемыс факторы внешней среды, например естественная радиация. Мутагенное действие могут оказывать также определенные компоненты питгюльных сред.
Существенная роль в возникновении спонтанных мутаций принадлежит таким процессам, как рекомбннация, репликация и репарация. Спонтанные мутации в популяции клеток по разным генам возникают с очень низкой частотой (в пределах 10 ' — 10 '). Однако если существует метод отбора (селекцин) мутантного фенотипа, то оказывается возможным обнаружить даже крайне редкие спонтанные мутанты. При наличии таких методов отбора часто предпочтение отдается выделению именно спонтанных мутантов, поскольку многие мутагенные факторы потенциально опасны для человека, а химические мутагены, кроме того, загрязняют окружающую среду.
Иидуцированные мутации происходят под влиянием опрелеленных, специально примененных физических, химических или биологических агегпов, называемых мугнагенами. Мутагенным действием обладают ионизируюшее излучение„УФ-лучи, ряд химических соединений, транспозирующиеся элементы и транспозон-подобные фаги (например, фаг Ми), а также мутации в определенных генах (гены-мутаторы). Разные мутагены обладают различными механизмами действия и эффективносгью в отношении конкретного организма.
Выбор мугагена определяется типом мутации, которую желательно получить, т.с. замена основания„делеция, сдвиг рамки считывания. Например, делеционные мутанты всегда имеют ярко выраженный фенотип, не бывают температурозависимыми'и условно летальными, истинные реверсни к дикому типу у них невозможны. Разные виды микроорганизмов могут требовать разных доз и условий для эффективного мутагенеза. С этой целью перед экспериментом следует построить кривую выживаемости клеток в зависимости от дозы мутагенного фактора или времени обработки.
Некоторые муга ены, используемые для получения мутаций у микроорганизмов, приведены в табл. 35.1. УФ-лучи. Простым и удобным методом получения мутантов разного типа у рзша гаикроорганизмов является ультрафиолетовое облучение. Для этого используются любые источники света с максимумом испускания в коротковолновой области (около 254 нм), например бактерицидные лампы. Поскольку УФ-лучи являются относительно слабым мутагеном, то наилучшие результаты получают при низкой выживаемости клеток (0,1— 1,0 %).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
