А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 126
Текст из файла (страница 126)
На следующий день подсчитывают количество негативных колоний на всех чашках. Если фаг не был нейтрализован, то после инкубации чашек обнаруживается около 1000 стерильных пятен. При инактивации 90 % фага их количество составит 100 и т.д. Например, если сыворотка в разведении 1: 100 инактивирует 90 % фага в течение 5 мин, то величина Х= 2,3.100/5 10(100/10), т.е. 46. Материалы и оборудование Термостат на 37 С; водяная баня на 48 С; качалка„' сушильный шкаф.
Стерильная посуда: флакон на 250 мл — ! шт; пробирки — 20; пипетки на 1 — 2 мл— 10; 5 мл — 5; чашки Петри — 4. Стерильные растворы: физиологический раствор (О,!5 М !хаС!) — 100 мл; питательный бульон — 30 мл; 1,5%-й питательный агар на питательном бульоне — 100 мл; антифаговая сыворотка — 0,5 мл; хлороформ. Культура Е. со!г', суспензия бактериофага с известным титром. РАЗДЕЛ Ч НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ ПРИКЛАДНОЙ МИКРОБИОЛОГИИ (ЭКОЛОГИЯ„БИОТЕХНОЛОГИЯ, САНИТАРНАЯ И МЕДИЦИНСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ) Глава 37 ЭКОЛОГИЯ И ТРОФИЧЕСКИЕ ЦЕПИ Выделение микроорганизмов из природных местообитаний и описание их физиолого-биохимических свойств, безусловно, относится к одному из важнейших методов микробной экологии.
Вместе с тем давно установлено, что при высеве на питательные среды удается получить рост лишь очень незначительной части природной микробной популяции (по разным оценкам, не более 0„1 — ),0%). И хотя в результате введения новых сред и усовершенствования методов культивирования число выделяемых видов микроорганизмов постоянно увеличивается, тем не менее информация о составе микробной популяции, получаемая при анализе роста на питательных средах, заведомо неполная. Это хорошо подтверждает сравнение результатов количественного учета микроорганизмов методами высева на питательные среды и подсчета клеток под микроскопом, а также сравнение с результатами посева данных, полученных с использованием ДНК-зондов.
В связи с этим для экологии микроорганизмов большое значение имеют методы, позволяющие, насколько возможно вести наблюдения за микроорганизмами непосредственно в их природных местообитаниях. Многие из подобных методов разработаны давно, но с развитием техники созданы их новые, усовершенствованные модификации. 37Л. МЕТОД СТЕКОЛ ОБРАСТАНИЯ Выдающимся микробиологом Н.Г.Хололным (! 882 — 1953) были разработаны такие методы прямого микроскопического изучения почвенных микроорганизмов, как метол стекол обрастания, метод почвенных камер, метод проращивания почвенной пыли на стекле. Эти методы подробно описаны в книге Д. М. Новогрудского «Почвенная микробиологияа", Наиболее широкое распространение получил метод стекол обрастания по Холодному — Росси, позволяющий увидеть «микробный пейзажа.
Суть метода заключается в микроскопическом изучении зафиксированных и окрашенных микробных обрастаний на предметных (или, по Росси, покровных) стеклах, инкубируемых в почве. * НовагрудскийЛ. 3Г. Почвеннаа микробиология. — Алма-Ага: Изд-во Каз. ССР, 1953. — С. 135— 139. 430 При постановке опыта в природных условиях (в лесу, поле) в исследуемой почве острым ножом делают вертикальный разрез. В него вставляют стерильное предметное стекло, плотно прижимают к почве и слегка надавливают ладонью на почву, чтобы ее плотность по возможности не изменялась.
Стекло оставляют в почве на разные сроки— от нескольких дней до недель и месяцев. Аналогичные опыты могут проводиться в лабораторных условиях, в наполненных почвой эксикаторах. Во время инкубации стекло покрывается почвенным раствором, и на его влажной поверхности начинают размножаться различные микроорганизмы, образуя, в конце концов, характерные для данной почвы микробиоценозы. По окончании опыта стекло осторожно извлекают из почвы, не допуская скользящего движения. Одну сторону стекла (нижнюю) тщательно вытирают.
Стекло фиксируют в пламени горелки, помещают в кювету с волопроводной водой и осторожно счмывают препарат от прилипших крупных частиц почвы, затем препарат высушивактг и окрашивают, Рекомендуется окрасить сгеюю! %-м карболовым эритрозином (время окраски 1 ч), промыть дистиллированной водой, высушить и микроскопировать с иммерсионным объективом. При микроскопировании отмечают взаимное расположение микроорганизмов, плотность обрастания, доминирующие формы. Вместо эритрозина можно использовать краситель акридин оранжевый (водный раствор„1: 10000, окраска 2 мин), затем промыть препарат в непроточной водопроводной воде (10 мин) и исследовать с помощью люминесцентной микроскопии. Клетки бактерий, светяьциеся зеленова ым светом, будут четко видны на красноватом фоне почвенных частиц, Подсчет числа бактериальных микроколоний, выросших на стекле за время инкубации в почве, и учет числа клеток (2, 4, 8, 16 и т.д.) в микроколониях позволяют с помощью соответствующего математического аппарата определить скорость миграции клеток в почве и время генерации бактерий.
Для этого имеются и специальные компьютерные программы, разработанные на кафедре биологии почв МГУ. Существуют различные модификации метода. Например, перед помещением в почву стекла покрывают какой-нибудь питательной средой или веществом, защищающим их от повреждений (фильтровальной бумагой, тканью и т.п.). Следует отметить, что метод стекол обрастания давно используется не только в почвенной, но и в водной микробиологии; в лимнологических исследованиях он бьи впервые применен известным гидробиологом Э.Науманном (под названием «пластин обрастания») при изучении микроорганизмов нла.
37.2. МЕТОД КАПИЛЛЯРОВ ПЕРФИЛЬЕВА Метод, позволяющий выявить «микробный пейзаж» в природных субстратах, был разработан Б.В. Перфильевым*. Для наблюдения за живыми микроорганизмами он предложил использовать капилляры с плоскопараллельными стенками (рис. 37.1).
Благодаря плоским стеклам и узкому прямоугольному просвету каналов капилляры с попавшими в них клетками можно рассматривать под микроскопом, причем при большом увеличении и с иммерсией. Создание подобных капилляров стало возможным благодаря разработке специальной капиллярной микростеклогехники, основанной на шлифовке и спекании листовых стеклянных пластин с их последующим растяжением. Для наблюдения за развитием микроорганизмов в илах Б.В.Перфильевым были сконструированы специальные приборы, представляющие собой наборы нескольких плоских капилляров, закрепленных на стеклянной палочке или специальном держателе, и бьщи названы лелосколы.
Пелоскоп помешают вертикально в стакан, куда ранее внесен ил из водоема. Иловой расгвор проникает в капилляры и распределяется, обра- " П«Р4!гм»ев Б. В., ГавеД. Р. Капиллярные методы изучения микроорганизмов. — М.-йе И»два АН СССР, 196!. — 534 с. 431 Рис. 37.1. Капилляры Перфильева (Б.В. Перфильев, Д.Р. Габе, 19б1): а — наборы капиллярных ячеек; б — лслоскоп; в — ледоскоп зуя микрозоны с различными физико-химическими условиями, аналогично тому, как зто имеет место в образце ила. Вместе с иловым раствором по соответствующим микрозонам распределякчся и микроорганизмы, воспроизволя так называемый вторичный диагенетический бактериальный илоной профиль.
Через некоторое время (от 2— 3 дней до нескольких месяцев) капилляры извлекают из ила, тщательно протирают снаружи и микроскопируют, отмечая состав и характер распределения микроорганизмов. Использование нелоскопа позволило Перфильсву исследовать микрозональное сзроение ила и происходящие в нем процессы мипералообразования, а также обнаружить и описать новые необычные микроорганизмы, которые не удавалось выделить на питательных средах. Многие из них характеризуются необычной морфологией и сложным циклом развития.
На аналогичных принципах основаны и другие сконструированные Б.В. Перфильевым приборы: лсдоскол — для анализа микробного пейзажа в почвах и грунтах, хрелосквл — для изучения микроорганизмов грунтовых и подземных вод, лерифилюлс иевр— для микроскопического исследования водных обрастаний. Использование зтих усзвновок позволило значительно расширить наши представления о разнообразии микроорганизмов, их взаимоотношениях и геологической деятельности. Разработанная Перфильевым капиллярная техника может быть использована и в других направлениях микробиологических исследований, например для выделения культур из отдельной клетки 432 (капиллярные методы одноклеточной изоляции, см. гл.б.), культивирования микроорганизмов (методы капиллярных микрокультур), а также для их количественного учета (капиллярный метод прямого счета микробных тел, см.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
