А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 129
Текст из файла (страница 129)
Продолжительность культивирования бактерий — 7— 10 сут. Получение накопительной культуры азотфиксаторов проверяют по образованию слизистых колоний (чвсто окрашенных при длительном росте в коричневый цвет) вокруг комочков почвы на чашках. При микроскопировании культуры обнаруживают обычно представителей родов Азотобосгег или Ве()еПяс/аа. Для выявления внеклеточных капсул используют метод негативного контрастирования (см.
гл. 5). При вьшслении накопительной культуры свободноживуших анаэробных азотфиксируюших баюерий рода С!огггийит используют среду Виноградского (состяв см. в приложении 4). В высокие пробирки вносят небольшое (0,5 — 1,0 г) количество почвы, наливают среду Виноградского, оставляя воздушное пространсгво в 1 см между пробкой и средой, и пастеризуют в течение 1О мин при 80 'С (в водяной бане). Пробирки помешают в термастат (30 'С) иа 5 — 7 сут. В таких условиях обычно вырастает С. рах1еипанит.
После окончания культивирования гомечают рост азотфиксаторов (помутнение среды, образование газа, появление запаха масляной кислоты) или его отсутствие. При микроскопировании культуры в препаратах «раздавленная капля» и «висячая капля» отмечают наличие подвижных палочек, образующих споры. В клетках бактерий выявляют характерные грануль1 крахмалоподобного вешества гранулезы. Для этого к капле суспензни клеток на предметном стекле добавляют каплю раствора Люголя. Включения гранулезы окрашиваются в синий цвет. 438 Для работы с чистыми культурами аназробных диазотрофов среду Виноградского стерилизуют при 0,5 ати, заливают в сзерильныс высокие пробирки до пробки и прогревают на кипящей воляной бане в течение 20 мин для удаления растворенного в среде кислорода. Затем срелу в пробирках быстро охлажлают под струей холодной воды я проводят посев суспензией микроорганизмов пипеткой на дно пробирки.
Диазотрофы обнаруживаются как в ассоциях с растениями, так и с животными. Доказана способность к азотфиксации у бакгерий кишечной группы рода л(еЫе)(а, живу~лик а качестве комменсалов в пищеварительном тракте человека. Главную роль в азотфиксации играет нитрогениза, представляющая собой комбинацию из двух белков. Молекула одного из них содержит два атома молибдена и около 30 атомов железа, молекула другого — только железо. В активации молекулы азота участвует молибден, а у некоторых бактерий — заменяющий его ванадий. Соединения железа используются как переносчики электронов. Процесс требует присутствия восстановителя с низким окислительновосстановительным потенциалом, ионов магния и АТФ, энергия распада которой используется для восстановления молибдена. Источниками энергии в почве могут быть гидролизуемые микроорганизмами растительные и животные остатки, а также почвенное органическое вещество.
Нитрогеназная система катализирует восстановление азота до аммония, который включается в молекулу глутаминовой кислоты в реакции, катализируемой глутаминсинтетазой: глутаминовая кислота + )х(Н'„+ АТФ -» глутамин ч АДФ + Ф„. Затем с помощью глутаматсинтазы осуществляется перенос амидной группы на молекулу а-кетоглутарата: а-кетоглутарат + глутамин -» 2 глутаминовая кислота. Азот, накопленный биологическим путем„находится в органических соединениях, главным образом в белке в аминной форме. Активность нитрогеназы снижается и подавляется при наличии более выгодного источника азота, чем атмосферный азот, например ионов аммония (звчДсп-ой-ейесг). Нитрогеназная система азотфиксаторов чувствительна к кислороду.
В снижении ингибирующего действия кислорода определенную роль играют морфолого-цитологические и физиолого-биохимические особенности клеток, в частности капсулы и дополнительные клеточные покровы, увеличение скорости дыхания (многие из диазотрофов имеют разветвленную дыхательную цепь). Нитчатые цианобактерии для разобщения процессов азотфиксации и фотосинтеза формируют специальные лифференцированные клетки — гетероцисты.
Представители рода 6!оеогЬесе (олноклеточные цианобактерии) способны к азробной азотфиксации за счет наличия мощного чехла, окружающего кчетки. Возможны конформационные изменения нитрогеназной системы. Поступление молекулярного кислорода в бактероиды контролируется леггемоглобипом — цитоплазматическим гемопротеином, в синтезе которого участвуют и растение, и бактерии-симбионты. В экспериментах фиксация атмосферного азота прокариотами легче выявляется при низком парпиальном давлении кислорода и в аназробных условиях. Вместе с тем недавно был выделен микроорганизм .Юергеглусез глеилоаи!о!горл(сиь нитрогеназная система которого не чувствительна к кислороду, а сам актиномипет способен к окислению СО. Другие особенности нитрогеназной системы этого микроорганизма — независимость от АТФ и неспособность восстанавливать ацепиен, в то время как»обычные» нитрогеназы восстанавливают ацетилен, азия и цианид.
439 38.2. АММОНИФИКАЦИЯ Амыонификация — это отщепление аминогруппы от аминокислоты с выделением свободного аммиака в процессе дезаминирования. Аммонификация производных белка — пептидов и аминокислот, представляет собой наиболее динамичное звено в цикле азота, хотя этому процессу подвержены и другие азотсодержащие органические соединения — производные нуклеиновых кислот, пуриновые и пиримидиновые основания, мочевина и мочевая кислота, азотсодержащий полисахарид хитин, гуминовые кислоты и др. Внсклеточпые прсчеазы микроорганизмов гилролизуют высокомолекулярные белки до пептидов различных размеров и аминокислот. В дальнейшем аминокислоты могут участвовать в синтезе белка и других полимеров, а также подвергаться переаминированию, дезаминированию или декарбоксилированию.
Пропесс отшепления аминогруппы с высвобождением аммиака может протекать как внутри клетки, так и внеклеточно. Гидролитическое разложение белков с одновременной аммонификацией продуктов такого пгдролиза легко выявизь, если чашку с МПЖ заразить маленькими частичками почвы или навоза. Можно слелать и укол в столбик МПЖ иглой, которой предварительно прикасаются к почве. Уже через ! — 2 сут в местах заражения можно наблюдать развитие гнилостных микробов (в просторечии процесс разложения белоксодержаших веществ называется гниением) и разжижение желатина.
По месту, где происходит разжижение желатина (сверху или в средней части или у дна пробирки), можно сказать, протекает ли этот процесс под влиянием аэробов или анаэробов (см. также разд. 14. ! 2). При разложении белка кроме аммиака образукпся СОь сероводород, жирные и ароматические кислоты, спирты, индол, скатол, метилмеркаптан и другие веШества. Наиболее активные аммонификаторы — это представители грампоножительных споровых бактерий из рола йасл!лз.
из не образующих эндоспоры форм к аммонификаторам относятся виды грамполоыпельных бактерий родов М!сгососсиз, АгтягоЬпс!еп МусвЬас!ег1игл, грамагрицатсльные виды рода Рюгепз, Рзеиг!отояаз,.а также многие микромицеты. Роль аммонификаторов в природе значительна„поскольку доля белка в тканях умерших растений и животных велика, а аммонифицируюшие микроорганизмы осушествляют минерализацию белков, разлагая их в конечном счете до СО„!чНз и Н,В. Образующийся при микробном разложении азотсодержагдих органических соединений аммиак часгично адсорбируе1ся в почве, позребляется как источник азота в процессе метаболизма почвенных микроорганизмов и в амлюнийной форме растениями (иммобилизуегся), выделяется в атмосферу, а также окисляется в нитриты и нитраты в процессе нитрификации. Для выделения аммоиификатаров используют мясопептонный бульон, который в количестве 30 мл наливают в колбы на 100 мл, куда затем добавляют 0,3 г почвы.
Колбы закрывают ватными пробками. Для обнаружения над средой аммиака, выделяющегося в процессе аммонификации„в колбе между стенкой и пробкой закрепляют лакмусовую бумажку, смоченную дистиллированной водой (бумажка не должна касаться срелы). Сверху колбочку закрывают пергаментной бумагой или полиэтиленом и ставят в термостат (30 С) на 4 — 6 сут. При образовании аммиака красный лакмус синеет. Выделение и условия культивирования аммонифицирующих бактерий описаны также в разд. 14.1. 440 38.3.
НИТРИФИКАЦИЯ Нитрификация является единственным в цикле азота процессом, ведущим к образованию окисленных форм азотистых соединений. Все известные хемоавтотрофные нитрифицирующие бактерии, окисляющие восстановленные формы азота, отнесены к семейству )Ч11гоЬасгег)асеае. Все они представлены грамотрицательными одноклеточными микроорганизмами, облигатными аэро- бами или микроаэроф илами. Они различаются по форме и размерам, способам размножения, типам жгутикования подвижных форм и другим характеристикам. В результате окисления аммиака нигрификаторы получают энергию для автотрофной ассимиляции СОз (см.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
