А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 133
Текст из файла (страница 133)
40.1. МЕТОДЫ УЧЕТА МИКРООРГАНИЗМОВ, РАСТВОРЯЮЩИХ ОРТОФОСФАТЫ КАЛЬ4ИЯ, АЛЮМИНИЯ И ЖЕЛЕЗА Одним из самых удобных методов выделения фосфатрастворяющих микроорганизмов является чашечный, когда активные организмы отбирают из колоний на агаровой пластинке в зонах растворения фосфата.
Эти зоны формируются четкими в случае, когда среда достаточно и равномерно мутна, а количество нерастворимого фосфата в ней сравнительно невелико. Поэтому наилучший эффект дает внесение в среду свежеосажденных солей. Дяя вьщеления из почвы бактерий, растворяющих ортофосфаты кальцтщ, используют глюкозоаспарагиновую среду Муромцева состава (г/л); глюкоза — 10; аспарагин— 1; Кз80~ — 0,2; М880д — 0,2; агар вьпцелоченный — 20; кукурузный экстракт — 0,02; вода водопроводная, рН 6,8. Стерилизация при 0,5 ати 25 мин. Фосфаты кальция Са,(РОх), вносят в питательную среду методом осаждения. Для этого в стерильную расплавленную агаризованную среду вносят (из расчета на 1 л) 3,4 г СаС1, бНзО, а после его растворения добавляют 3,8 г 1ЧазРОг12Н,О.
Соли вносят в сухом виде, по позволяет избежать быстрого гидролиза 11 а„РО, в растворе и обеспечивает постепешюе взаимодействие СаС!тбНзО и ХазРОд по мере их растворения. На 1 л 450 среды образуется 1,5 г свежеосажденного Саз(Р04)ь Приготовленную таким образом питательную среду разливают в чашки Петри и после застывания агара засевают поверхностно 0,1 мл почвенной суспензии из разведений 10 4 — 10 ', которые готовят из 1 г почвы и 100 мзз стерильной водопроводной воды (разведение 1О ').
Чашки инкубируют при 28 — 30 'С в течение 3 — 9 сут. По образованию зон просветления вокруг колоний активных микроорганизмов судят о растворении фосфата кальция. Наряду с внесением в среду свежеосажденных солей можно пользоваться и готовыми препаратами фосфатов, но зоны растворения получатся менее отчетливыми.
Готовые фосфаты в агаризованную среду вносят в следующих количествах (г/л): Са,(Р04), — 4 — 5; фосфорит — б — 7; апатит — 8 — 10. Порошок Фосфата всыпают в горячий расплавленный агар и дают отстояться для осаждения крупных часпщ. Среду сразу же разливают в чашки и засевают почвенной суспензией. Для выделения из почвы микроорганизмов, способных к растворению ортофосфатов Ге и А1, используют свежеосажденные фосфаты, которые получают из солей алюминия и железа.
С этой целью для получения А1РОх или РеРО4 смешивают по 10 мл стерильных растворов ГеРО, и Л1С1з или )ЧазРО4 и РеС1з соответственно. Стерилизацию растворов проводят, пропуская их через фильтр Зейтца. Осажденный фосфат алюминия или железа после тщательною перемешивания вносят в расплавленную глюкозоаспарагиновую среду Муролзцева (см. выше). На 1 л среды берут 570 мг )ЧазРО4 12НзО и 362 мз.
А1С! з. 6НзО или 405 мг ГсС(з. 6Н,О. Готовая среда содержит 264 мг Л!РО4 ЗН,О или 280 мг РеРОз 2Н,О в 1 л. Зна зенис рН среды доводят до 6,8 10%-м раствором !ЧаОН. По 0,1 мл почвенной суспензии из разведений 10 ~ — 10 т высевают на чашки со средой. После инкубации при 28 — 30 С в течение 3 — 10 сут вокруг колоний выросших микроорганизмов видны зоны просветления. В почве не обнаружены специфичные микроорганизмы, растворяющие ортофосфаты кальция, железа и алюминия. В этом процессе бактерии участвуют лишь косвенно.
Так, многие микроорзанизмы в процессе дыхания выделяют углекислоту, нитрифнцирующне бактерии, окисляя аммоний, образуют азотистую и азотную кислоты, серобактерии, окисляя сероволорол и серу, продуцирузст серную кислоту. Эти кислоты взаимодействуют с Фосфатами и образуют кислые соли, доглупные растениям: Са,(РО,), + 2СО, + 2Н,О = 2СаНРО4+ Са(НСОз),; Саз(Р04), ь 2Нг804 = Са(НгРОз)з ь 2СаБОй Саз(Р04)з + 4НгзОз = Са(НгР04)з + 2Са(!ЧОз)з. Сходным образом действуют на фосфаты и бактерии, образующие органические кислоты в процессе ассимшзяции углеводов.
40.2. МЕТОДЫ УЧЕТА МИКРООРГАНИЗМОВ, РАСТВОРЯЮЩИХ ФИТАТЫ КАЛЬЦИЯ, АЛЮМИНИЯ И ЖЕЛЕЗА Органические соединения фосфора в почве, органофосфаты, представлены в нейтральных и щелочных почвах в основном фитатами Са и М8, а в кислых— фитатами Ре и А1. Для обнаружения в почве бактерий, способных растворять фитаты, используют глюкозоаспарагиновый агар с соответствуюзцим фитатом. В качестве фитата Са — М8 используют препарат фигни, представляющий собой кальций-магниевую соль инозитфосфорпой кислоты. Фитин предварительно растворяют и переосаждают. Для этого 0,5 г препарата растворяют в 10 мл 1 н. НС1 и добавляют 1 н.
раствора )ЧаОН до рН 7,0. Выпавший осадок фитата Са— 451 М8 отстаивают, отделяют от надосадочной жидкости и вносят в 500 мл ппокозоаспарагиновой среды. Посевы разведений почвенной суспензии инкубируют 10 — 12 сут при 28 — 30 'С. Соли Ре и А1 получают из фитина.
Для этого препарат растворяют в 2%-й НС1 и осаждают фосфат концентрированным водным раствором РеС1,. Обильный осадок фитата Ге отделяют на воронке Бюхнера и промывают соляной кислотой до тех пор, пока смывной фильтрат не перестанет мутнеть при нейтрализации его )х1аОН до рН 7,0. Фитат А1 получают таким же методом с помощью раствора А1С1з, однако перед внесением хлористого алюминия рН раствора фитина в 2%-й НС1 предварительно доводят с помощью ХаОН до значения 3,5. Осадок фитата А1 отделяют на воронке Бюхнера и обрабатывают аналогично фигату Ре. Полученные таким образом фитатьг Ре и А1 вносят в горячий глюкозоаспарагиновый агар в количестве 0,5 г на 500 мл среды, размешивают до получения равномерного помутнения и, доведя рН до 7,0, разливают по чашкам Петри. Посевы разведений почвенной суспензии инкубируют 10 — 12 сут при 28 — 30 'С и подсчитывают количество колоний, вокруг которых образовались зоны растворения органофосфатов. Микробиологическое растворение фитатов в основном имеет характер неферментативного и неспецифического, как это имеет место в случае растворения ортофосфатов кальция, алюминия и железа.
Однако обнаружены и микроорганизмы, способные к ферментативному дефосфорилированию органических соединений фосфора с помощью фосфатазы. Это некоторые ппаммы Вллейагстап и Рхеиг/отолак Глава 41 МИКРООРГАНИЗМЫ, УЧАСТВУЮЩИЕ В РАЗЛОЖЕНИИ СИЛИКАТОВ Микроорганизмы, разрушающие горные породы, давно известны исследователям. По способу питания это гетеротрофы. Они участвуют в процессах вывстривания косвенным образом, образуя кислые продукты своего метаболизма — органические или неорганические кислоты, и переводя нерастворимые компоненты скальных пород в растворимые соединения, вымываемые впоследствии дождевыми осацками.
Лучшего развития такие микроорганизмы лостигают на средах с полевым ишатом и биотитом, мобилизуя фосфор и калий из этих минералов для биосипгетических целей. Имеется целый ряд свидетельств выделения из почв так называемых сипгкатных бактерий, которые распюряют алюмосиликаты с высвобождением волорастворимых калиевых соединений, усваивасмых растениями. Силикатные бактерии встречаются на поверхности скальных порол, лишайников, мхов и воцорослей. В почвах такие бактерии конценгрируются на поверхности корней, получая основной поток углерода в виде корневых экссудегов органической приролы. В почве количество силикатных бактерий может лостигать 10~ кл/г, такое же высокое число обнаруживают и на поверхности водорослей. Выделение силикатных бактерий проводят на среде с алюмосиликагаами и крахмалом (г/л): крахмал — 20,0; алюмосиликат калия — 2,0; СаСОз — 2,0; Саз(РО4)з — 1 51 М88Од'7НзО 0 151 )х)аС1 0 151 Мп804 0 051 Ре80л 452 0,05; агар — 15,0; вода водопроводная — до 1 л.
Стерилизациия при 1 атм; рН около 7,0. Алюмосиликат калия можно заменить толченой слюдой или толченым калиевым стеклом. Для выделения силикатных бактерий можно использовать и пластинки силикагеля (приготовление см. в гл. 3), пропитанные средой Эшби, используя в качестве посевною материала комочки почвы или почвенные суспензии в соответствующих разведениях. Для активации силикатных бактерий исследуемую почву выдерживают 2 суг при влажности 60 — 80% от полной влагоемкости при 25 С. Через 2 — 3 сут в условиях культивирования при 28 — 30 'С на поверхности среды появляются выпуклые, прозрачные, часто слизистые (экзополисахарнды) сливающиеся колонии силикатных бактерий.
На поверхности среды при прибавлении к пей 0,1% ()ЧНс),804 развиваются мелкие несливающнеся колонии спорообразуюших силикатных бактерий. Клетки колоний окрашивают фуксином и метиленовой синью; капсулы выявляют негативным контрастированием с тушьто (см. гл. 5). Среда (г/л) для длительного хранения ссгорообразусои<их силикаснньсх бактерий„которые часто применяют в качестве бактериального удобрения: крахмал— 10,0; КН,Р04 — 0,3; !чаС! — 0,5„М8СОз — 1,0; К)ч08 — 1,0; агаР— 20,0. Культуры выращивают на скошенном агарс и после окончания пропссса спорообразования заливают стерильным вазелиновым маслом.
Хранят культуры при 4 — 6 'С. В таких условиях споры сохраняют жизнеспособность в течение 2 — 3 лет. Глава 42 БАКТЕРИАЛЬНЫЕ УДОБРЕНИЯ Многие почвенные микроорганизмы улучшают плодородие почвы, минерализуя органические и неорганические соелинения, повышая эффективность использования минеральных и органических удобрений, обогащая почву молекулярным азотом атмосферы и синтезируя ряд полезных для растений веществ — полисахаридов, белков, витаминов, гормонов роста, антибиотиковфунгицидов и т.и. В результате резко повышается урожайность растений.
В и!х<ктике сельскою хозяйства нашли применение несколько типов бактериальных удобрений, которые обогащают почву и корневую систему растений полезными микроорганизмами: нитрагин, ризоторофин, азотобактерин, фогфобакверин. 42.1. НИТРАГИН И РИЗОТОРФИН С давних пор в сельском хозяйстве практиковалось восстановление и улучшение почв путем выращивания на них бобовых растений. Еще в 1820 г. а России появилось Общество сельского хозяйства, пропагандирующее выращивание бобовых. Роль микроорганизмов в питании растений была выяснена через много лет.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
