А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 132
Текст из файла (страница 132)
Отобранные проростки злаков в фазе чистого» растяжения, выращенные в течение 3 дней до длины колеоптилей 25 — 30 мм, укладывают на линейку. Отступая от верхнего кончика 4 мм, отрезают лезвием сегмент длиной 5 мм, из которого капишшром удаляют первичный лист. Отрезки помещают на 2 ч в чашки Петри, наполненные дистиллированной водой со следами сульфата магния, после чего их переносят в стерильные чашки Петри с 20 мл стерильной культуральной жидкостью микроорганизмов 01ля зкономии можно использовать одноразовые чашки Петри диаметром 3,5 см и 2 мл культуральной жидкости). В качестве контроля используют неинокулированную микроорганизмами питательную среду, а также растворы индолилуксусной кислоты 1ИУК) — 10, 50 и 100 мкг/мл на 5 мМ калийфосфатном буфере, рН 6,0.
Инкубацию проводят в темноте во влажной камере в течение 20 — 35 ч при температуре 25 'С. Измеряют длину отрезков колеоптилей и определяют среднюю величину для каждой группы колеоптилей, взятой в эксперимент. Для получения статистически верных результатов эксперимент необходимо проводить в 3 — 5 повторностях, отбирая для каждой группы не менее 10 отрезков колеоптилей. 447 Определение влияния стимуляторов роста на корнеобразование у черенков фасоли В этом биотесте используют черенки фасоли обыкновенной (Раино!их ги1яга1х). Для этого сортовые семена фасоли выдерживают в мыльном растворе в течение 20 мин, промывают в проточной водопроводной воде 1 ч и раскладывают в кювету на стекло, обернутое влажной фильтровальной бумагой. В кювету наливают воду до уровня стекла и помещают в термостат при 20 — 24 'С. Проросшие семена переносят в сосуды на специальные пластиковые круги с отверстиями так, чтобы наклюнувшиеся корешки оказались в воде.
Инкубацию проводят при естественном или искусственном 1люминостат с фотопериодизмом) освещении при температуре 20 — 24 С. В эксперименте используют черенки фасоли длиной 12 — 14 см с первой парой листьев, у которых поп водой отрезают базальные части на расстоянии 0,5 — 1,0 см выше корневой шейки. Такие черенки в количестве не менее 5 штук в одном варианте опыта погружают нижними концами на 6 ч во флаконы с культуральной жидкостью микроорганизмов. Контролем служат черенки, помещенные в стерильную водопроводную воду и стерильную неинокулированную среду. Также можно использовать растворы кинетина (цитокинина) в концентрации 2 мкг/мл, ИУК в концентрации 1О, 50 и 100 мкг/мл и их комбинацию.
Черенки должны быть погружены в растворы на 3 — 4 см. После того как черенки вынимают из опытных растворов, их ополаскивают водопроводной водой и помещают в колбы или иные флаконы с водопроводной водой, которую меняют каждый день на протяжении эксперимента. Колбы держат в условиях естественного освещения при комнатной температуре или в люминостате. Показателями активности ростовых стимуляторов служат время появления корней на черенках, высота стебля, на котором закладываются корни, длина и количество образуемых корней.
Последние три характеристики учитывают через 1 — 2 нед после постановки опыта. Эксперимент проводят в трех-пяти повторностях. Определение влияния гиббереллина на рост гипокотилей салата Биотест проводят на гипокотилях (подсемядолыюе колено) проросших семян салата 1Хасгиса хагЬа). Для этого семена выдерживают в кювете на стекле, обернутом влажной фильтровальной бумагой при 25 С в темноте в течение двух дней.
Затем отбирают проростки с одинаковыми по длине корешками (6 — 8 мм) и помещают их в стерильные чашки Петри на диск фильтровальной бумаги, смоченный 6 мл КЖ микроорганизмов, а также раствором гиббереллиновой кислоты (СЛз) в концентрации 25 мг/л. В качестве контроля используют стерильную неинокулированную среду.
Для каждой пробы берут по 10 проростков. Инкубацию проводят, располагая опытные кюветы па 15 см ниже постоянного источника света — ламп дневного освещения, с температурой в этом положении около 25 'С. Измерение длины гипокотилей проводят в течение 5 сут. Другим вариантом опыта является прорашивание семян салата при постоянном освещении и измерение длины гипокотилей через 3 сут.
В этом случае свет увеличивает ингибирование собственного роста гипокотилей салата, но не изменяет их чувствительность к гиббереллиновой кислоте. Определение влияния цитокининов на сохранение хлорофилла в листовых отрезках ячменя Для биотеста, разработанного О.Н.Кулаевой, используют листья первого яруса сортового ячмеьи, который выращивают в комнатных условиях в сосудах или ящиках с землей. В возрасте 1Π— 15 сут отбирают сходные по размеру и цвету листья первого яруса.
Из них вырезают отрезки длиной 2 см, отступив на 2 см от нижнего края листа. Сегменты раскладывают в стерильные чашки Петри на фильтровальную бумагу диаметром 10 см, смоченную 3 мл КЖ микроорганизмов. В каждую чашку помещают до 9 листовьгх отрезков. Чашки оставляют под стеклом в кювете при искусственном освещении лампами дневного света и температуре 20 — 25'С. В качестве контроля используют стерильную неинокулированную среду, дистиллированную воду, а также растворы кинетина в концентрациях 1Π— 20 мг/л. Навеску растворяют в дистиллировашюй воде, добавляя по каплям 0,1 н. )чаОН (или КОН), перемешивают и нагревают на водяной бане до полного растворения. Сохранение хлорофилла в се~ментах листьев ячменя оценивают через 7 — 10 сут инкубации визуально (для качественного определения) или экспериментально.
Для этого из отобранных трех отрезков вырезают пробочным сверлом по два диска диаметром 5 мм. Диски объединяют и растирают с 80%-м этанолом в фарфоровой чашке для упаривания, добавляя на кончике ланцета кварцевый песок и СаСОз. Полученный раствор количественно переносят в центрифужную пробирку и отделяют осадок центрифугированием в течение 5 мин при 2 тыс. я. Осадок отбрасывают, а объем надосадочной жидкости доводят до 5 мл 80%-м этанолом. Оптическую плотность раствора определяют на спектрофотомечре при бб5 нм против контроля, которым является раствор, полученный путем объединения экстрактов хлорофилла из отрезков листьев на воде или неинокулированной среде, а также 80%-й этанол.
Результаты выражают в оптических показателях спектрофотометра, умноженных на 1000. Для одной чашки Петри проводят три определения содержании хлорофилла в отрезках (всего 9 листовых сегментов на чашку), в эксперимент берут 3 чашки Петри. Для построения калибровочной кривой используют отрезки листьев ячменя, которые раскладывают на фильтровальную бумагу, смоченную растворами кинетина разных концентраций от 1 до 50 мг/л. Контролем служат отрезки листьев на дистиллированной воде.
Результаты биотестов зависят от ряда причин, в частности от чувствительности выбранного тест-объекта к ростовым стимуляторам, содержащимся в культуральной ткилкости микроорганизмов, а также ст их концентрации. Если их количество будет ниже или выше действующей концентрации, то может бьгп отмечено угнетающее действие вещества. В ряде случаев, если микроорганизм-продуцент синтезирует значительные количества фигогормона, культуральну1о жидкость необходимо разводить. Кроме того, в культуральной жидкости помимо необходимого ростового стимулятора может содержаться значительное количество других биологически активных веществ, которые также влияют на растительные обьекты и, таким образом, на конечный результат эксперимента.
Биотесты дают ответ на вопрос о биологической активности фитогор- 449 !5и р~ монов, содержащихся в культуральной жидкости, но для определения их количеств и концентрации необходимо параллельное проведение экспериментов по идентификации фитогормонов с помощью колориметрического метода с реактивом Сальковского (опредсление ауксинов), а также хроматографическопо и иммуноферментного методов. При проведении тонкослойных хроматограмм ве обработанные химическими реагентами зоны, соответствующие по показателям Аг идентифицированным фитогормонам, вырезают и элюируют из алсорбента действующее вещество. Подобные экстракты можно использовать в вышеописанных биотестах. Глава 40 БАКТЕРИИ, МИНЕРАЛИЗУЮЩИЕ СОЕДИНЕНИЯ ФОСФОРА Фосфор содержится в почве, как правило, в виде труднодоступных минеральных и орг анических соединений, кгпорые становятся доступными для растений только после их минсрализации микроорганизмами.
Минеральные вещества представлены главным образом ортофосфатами кальция (нейтральные и щелочные почвы), железа и алюминия (кислые почвы). Органические соединения фосфора встречаются в виде инозитфосфатов, фосфорсодержащих белков, нуклеиновых кислот, фосфолипидов и др. Около половины органического фосфора почвы содержится в наиболее устойчивых к действию микроорганизмов фосфатах инозита (фитатах). Особенно широко распространен инозитолтексафосфат (фитин). Микроорганизмы, синтезирующие фосфатазу, способньт отщеплять от органических фосфатов фосфорную кислоту, которая, взаимодействуя с катионами, переходит в соли фосфорной кислоты, доступные для растений.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
