А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 134
Текст из файла (страница 134)
Растениями лучше усваиваются аммонийный и нитратный азот, чем азот органических соединений, за исключением аспарагина, глутамина и мочевины — соединений, лающих аммоний- 453 ный азот. Поэтому большое значение для питания растений имеют почвенные организмы, которые минерализуют содержащийся в почве органический азот, превращая его в аммиак, который используется растениями для синтеза аминокислот и белков. г)иглрагин представляет собой бактериальное удобрение, основой которого являются жизнеспособные клетки клубеньковых бактерий рода ЛихоЬ1ит.
Ннтрагин применяют для повышения урожая различных бобовых растений — фасоли, гороха, сон, клевера, люцерны, люпина, эспарцета, виюг н др. Чистая культура клубеньковых бактерий бьща выделена М. Бейеринком в 1888 г. Клубеньковые бактерии — это грамотрицательные аэробные подвижные палочки размером 0,5 — 0,9 х 1,2 — 3,0 мкм. При росте в жидкой среде с псремешиванием культуры достигают стационарной фазы роста через 2 — 3 сут инкубации.
Среду с минеральными свами и маннитом или другими углеводами при росте эти бактерии подкисляют. Их рост на среде с углеводами обычно сопровождается обильным образованием внеклеточной слизи полисахаридной природы. Источниками азота могут служить соли аммония, нлпрат, нитрит и большинство аминокислот. Характерной особенностью клубеньковых бактерий является их способность проникать в корневые волоски бобовых растений семейства Еебиттозае умеренного пояса, а также некоторых представителей бобовых тропического пояса, вызывая образование корневых клубеньков, внутри которых эти бактерии присутствуют как внутри- клеточные симбионты.
В корневых волосках бактерии образуют бактероиды — специфические формы бактерий рода ЯЬРгоИит, окруженные мембранами растительного происхождения. Живущие в почве бактерии рода Иигобгит прикрепляются к корневым волоскам растения-хозяина, вызывают их деформацию, скручивание и формирование инфекционной нити. Оболочка, образовавшаяся из инфекционной нити и окружающая цигоплазму клетки ЯЬцоЬГит, называется нерибактероидной мембраной.
Именно такие формы ризобий называют бактероидами. Дальнейший рост и дифференциация бактероидов приводит к развитию крупных клеток неправильной формы — симбиосом, которые окружены симбиосомной мембраной. Они отличакп ся от клубеньковых бактерий, развивающихся вне растений, более крупными размерами, высоким содержанием гликогсна и жира, большим количеством волюгиновых гранул (внутриклеточный резерв Фосфата) и активной фиксацией молекулярного азота. Бактероиды и симбиосомы теряют способность к существованию в форме свободноживуших кзеток ИизоЬ1ит из-за нарушения у них так называемого «генетического лула». Клубеньковые бактерии в Форме бактероилов образуют нитрогеназный ферментный комплекс, который восстанавливает молекулярный азот до аммиака. Аммиак вовлекается в ряд ферментативных реакций, приводящих к образованию аминокислот, идущих на биосинтез белка.
Различают активные и неактивные культуры клубсньковых бактерий. Под активностью бактерий понимают способность их в симбиозе с бобовым растением Фиксировать атмосферный азот. Клубеньки, образованные активными щтаммамн АМоглит, отличаются от клубеньков, сформированных неактивными штаммами. Первые окрашены в розовый цвет благодаря наличию в них пигмента леггемогвобина, вторые имеют зеленоватую окраску и не способны Фиксировать азот. Кроме критерия активности в характеристике штаммов клубеньковых бактерий применяют крлперий вирулентности — способность вступать в симбиоз с бобовым растением путем быстрого проникновения в корень через корневые волоски и вызывать образование кзубеньков.
В симбиотическом комплексе растение — бактерии растение обеспечивает бактерии необходимыми шпательными веществами и создает для них оптимальные условия роста. Бактерии, находяц1иеся в клубеньках, снабжают растение азотом. Накопление азота в почве при участии клубеньковых бактерий может достигтгь ло 300 кг па 1 га в год. Следует отметить, что бактерии без участия растения т Ито практически не способны фиксировать азот.
Возможность незначительной фик- 454 сации (Чз чистыми культурами клубеньковых бактерий показана в лабораторных условиях при низком парциальном давлении кислорода. Клубеньковые бактерии различных видов обладают индивидуальной ггзбирательной способностью в отношении инфицирования бобовых растений. Эта способность связана с их вирулентностью. Так, лля типового вида Л.
1ехшлтозапил растениями-хозяевами являются горох, вика, чина, чечевица, кормовые бобы, клевер, фасоль, для Л. глейог(— люцерна, донник и тригонелла, а для Я.1ог( — только лядвенец. Важно, что вирулентность и видовая избирательность взаимосвязаны и не являются устойчивыми признаками штаммов клубеньковых бакшрий. Промышленную селекцию рнзобий осуществляют по обоим этим признакам. Практическое использование клубеньковых бактерий фактически началось еще в середине Х(Х в., когда почву, на которой до того выращивали бобовые культуры, в количестве 3 — 5 т/га разбрасывали по полям, где также планировали посевы бобовых и глс они раньше не выращивались.
Олнако в конце Х1Х вЂ” начале ХХ в. стали применять более эффективный метод: клубеньки с корней бобовых подсушивали, тонко измельчали и размешивали с наполнителями (тальк, бентонит). Такими препаратами, получившими название литрагин, обрабатывали семена бобовых перед посевом в США (1986), Германии (1896), Венгрии (1898), Англии (1906), России (1907).
В настоящее время препараты клубеньковых бактерий производят и применяют во многих странах. Самыми распространенными видами нитрагина являются почвенный, сухой и люрфяаай ~ризо~лоргйин). Почвенный нитрагин представляет собой культуру клубеньковых бактерий, выращенную в стерильной садовой почве. Стерильную почву, обычно в стеклянных сосудах, инокулируют жидкой культурой клубеньковых бактерий и выращивают в термостате при 28 С. В 1 г такого препарата должно содержаться не менее 300 млн клеток. Препаратом обрабатывают семсна бобовых перел посевом.
Однако такая технология производства препарата очень трудоемкая и дорогостоящая, а сам он неудобен в применении. Более совершенна технология производства сухого нитрагина — порошка высушенных клеток бактерий роля КЬКоЫшл в смеси с наполнителсм (каолин, бснтонгп, мел). В 1 г такого порошка при влажности 5 — 7% содержится не менее 10 млрд жизнеспособных клеток бактерий. Исходную культуру клубеньковых бактерий выращивают на одной из агарнзованных сред, например, содержащей (г/л): отвар гороха — 100; сахароза — 15; агар — 20; рН 6,8 — 7,0. На этапах промышленного производства бактерии выращивают в ферментерах на жилкой среде с кукурузным экстрактом или мелассой, (ХН,),30п КН2РО4 КзНРОч М8804 и СаСОь Значение рН поддерживается в диапазоне 6,5 — 7,0 при интенсивности аэрации в соотношении — 1 объем воздуха на 1 объем среды в 1 мин.
Суспензию клеток из ферментера, содержащую около 10 млрл клеток в 1 мл, сспарнруют. Биомассу в виде пасты с влажностью 70 — 80 % смешивают с защитной срелой, содержащей, например, 20% мелассы и 1% мочсвины, и высушивают в вакуум-сушильных установках или в распылительных сушилках. В порошка определяют количество жизнеспособных бактерий в 1 г, смешивают с наполнителями, фасуют и герметизируют в полиэтиленовые пакеты по 0,2 — 1,0 кг, которые хранят при температуре 8 — 12'С в течение 6 мес.
Клетки клубеньковых бактерий, как и других неспоровых микроорганизмов, очень чувствительны к потере воды, поэтому даже при строгом соблюдении технологических параметров большая часть клеток в процессе высушивания погибает. Этого удается избежать в торфяном нитрагинс — ризоторфиле. Для получения ризотрофина торф освобождают от корней, высушивают ло 25— 30% влажности и размалывают так, чтобы размер частиц не превышал 0,1 мм. Размолотый торф увлажняют до 35 — 40%, прибавляют СаСО, в таком количестве, чтобы довести рН ло 6,3 — 7,0, и расфасовывают в тонкие полиэтиленовые мешки по 100— 500 г.
Запаянные пакеты с торфом стерилизуют радиационным способом с использованием мощных гамма-установок. В пакеты со стерильным торфом в стерильном авто- 455 матизированном боксе специальной иглой вносят жидкую посевную культуру определенного вида клубеньковых бактерий в количестве 80 мл на каждые 250 г торфа. Норму засева выбирают так, чтобы исходный титр бактерий в инокулированном торфе составлял окало ! млрл клеток на ! г препарата влажностью 50 — 60%. До инокуляции в жидкую культуру вносят стерильные растворы мелассы, Лекстрина или мелочной сыворотки в таком количестве, чтобы их количество составляло в итоге около 3 к массе сухого торфа. Если необхолимо быстро получить готовый препарат и использовать его, инокулированные пакеты помешают на 5 — 7 сут в тсрмостат при 20 — 22'С. Для ллительного хранения в течение 6 мес пакеты сразу же ставят на хранение при !2 — !5 'С.
Содержание клеток клубеньковых бактерий в ризоторфине через 6 мес после его изготовления должно бьггь не ниже 3 — 4 млрд в ! г препарага. Наиболее распространенный метод применения нитрагина и ризоторфина— это предпосевная обработка семян в день их посева из расчета 200 г сухого нитрагина и 500 г. ризоторфина на 1 га. Применение фосфорно-качиевых и органических удобрений повышает эффективность препаратов клубеньковых бактерий.
Нитрагин и ризоторфин увеличивают урожайность бобовых на нолях, где они выращиваются впервые, в некоторых случаях до 100%. 42.2. ЭКСПРЕСС-МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КЛЕТОК КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ В СУХОМ НИТРАГИНЕ В 99 мл стерильной водопроводной воды разводят 1 г сухого нитрагина и выдерживают на качалке в течение 2 ч при 200 об/мин. Затем суспензию клеток помещают в пробирку и окрашивают раствором примулина (конечное разведение 1: 1000).
Через 15 мин 0,01 мл окрашенных клеток наносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом 1Зх18 мм, края которого заливают расплавленным парафином. Под люминесцентным микроскопом МЛ-2 препарат просматривают и подсчитывают общее количество клеток и процент живых клеток в 1 мл суспензии по методу Виноградского — Шульгиной (см. гл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
