А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 131
Текст из файла (страница 131)
Денитрифицируюшие бактерии широко распространены в почвах, особенно во влажных и богатых неразложившимися органическими остатками, в ризосферах, а также в илах. Для получения накопительной культуры деиитрифицирующих микроорганизмов используют среду Гпльтея. Раствор 1: КХО, — 2 г; аспарагин — 1 г, дистиллированной воды — 250 мл. Раствор П: натрий лимоннокислый — 2,5 г; КН,РО4 — 2,0 г; М8804 7 НтΠ— 2,0 г; СаС1з — 0,2 г; ГеС!з — следы; дистиллированная вода — 500 мл. Оба раствора сливают и доводят объем среды до 1000 мл. По индикатору бромтимоловому синему устанавливают рН 6,8 — 7,2.
Среду стерилизуют при 1 ати и разливают в высокие пробирки, оставляя воздушное пространство в 1 см между пробкой и средой. Предварительно в каждую пробирку помещают стеклянный поплавок (запаенным концом вверх) так, чтобы он был полностью заполнен средой. После заражения почвой или илом пробирки помещают в термостат (25 — 30'С). Среду в одной пробирке оставляют незасеянной для контроля. Обильное газообразование, исчезновение нитратов с появлением нитритов, возможно и аммиака, свидетельствует об идущей денитрификации.
О наличии или отсутствии нитратов судят по качественной реакции с дифениламином (см. 38.3). Происходит подщелачивание среды, которое определяют с помощью бромтимолблау. Накопительную культуру микроскопируют в препарате «раздавленная капля» и делают фиксированный, окрашенный фуксином, препарат. Для количественного определения дешпрификаторов пользуются МПА, содержащим 0„1% К)ЧОз и ! % агара. Посев проводят методом предельных развелений. О содержании денитрифицируюших бактерий в посевном материале судят по пузырькам и эазрывам в агаре, образовавшимся вследствие выделения денитрификаторами газа. Для обнаружения этих микроорганизмов пользуются средой Оиелянского: К??От — 5,0 г; крахмал растворимый — 5,0 г; пелтон — 1,0 г; КгНРО4 — 0,5 г; МК504.7Н,Π— 0,3 г; ХаС? — 0,3 г; К? — 0,5 г; агар-агар — 20,0 г; дистиллированная вода — 1000 мл.
Около выросших колоний вырезают кусочки агара и опускактт их в раствор 5%-й осанной кислоты: в присутствии нитритов агар посинеет. Выделение денитрификаторов производится на одной из вышеуказанных жидких сред, к которым прибавляют агар. Для оздания анаэробных условий используют методы, описанные выше.
Для выделения денитрификаторов, окисляющих серу в серную кислоту, пользутотся средой Бейеринка: серный цвет — 100 г; КХОт — 0,5г; ХатСОз — 0,2 г; СаСО, — 20,0 г; КтНРОт — 0,2 г; дистиллированная вода — 1000 мл. Посевным материалом является почва, При 30 'С через 5 — б суг уже заметно восстановление нитратов и накопление серной кислоты (газ, 804т и др.). Повторный пересев производят на ту же среду с дистиллированной водой и 0,01 % хлористого магния. Выделение развившейся перетрихиальной палочки АсиП((т(о(тас(1!из с(ен(от((саня производят на агаризованной среде в анаэробных условиях. Для накопления Юи(р(топтаная с(ен((пдсаттг тмелкие палочки с монотрихальным типом жтутикования) используют среду г(йске: МатбтОт — 5,0 г, КНОт— 5,0 г„ИатНСО,)т — 1,0 г; КтНР04 — 0,2 г; МяС?т — 0,1 г; СаС1, и РеС?3— следы; вода — 1000 мл. Для создания анаэробных условий колбочку заполняют средой до резиновой пробки.
Для выхода тазов в пробку вставляют трубку, которая отходит в сосуд с той же средой. Стерилизуют среду текучим паром. Исходными субстратами тцтя засева могут быть почва, стоячая вода или ил. Температурный оптимум 30 — 35 'С. 38.5. АССИМИЛЯЦИОННАЯ НИТРАТРЕДУКЦИЯ Восстановление нитрата в реакциях конструктивного метаболизма, не приводящее к получению энергии, называется ассиятиляциоттной нитратредукцией.
Способность к ассимиляции нитрата характерна для растений, некоторых грибов и бактерий. В целом процесс можно охарактеризовать следующими реакциями, которые катализируются редуктазами: ХО, -+ ??От -+ Н1~0 -+ ННтОН вЂ” т ХНт -+ аминокислоты. Амонийньтй и нитратный азот, поглощенный микробными клетками, включается в органические азотсодержащие полимеры клеточных компонентов и временно выводятся из круговорота азота, т.е. происходит их иммобилизация. Глава 39 ЛАБОРАТОРНЫЕ ОПЫТЫ С РАСТЕНИЯМИ В микробиологической практике растительные объекты используют, в частности, для изучения влияния микроорганизмов на рост растений и в биологических тестах прн обнаружении активности фитогормонов, синтезируемых микроорганизмами.
Чаще всего тест-объектами являются сельскохозяйственные культуры: пшеница, просо, овес, ячмень, раис, кукуруза, фасоль, горох, лутг, помидоры, огурцы. Для экспериментов отбирают одинаковые по размерам и внешнему виду семена одного сорта с хорошей всхожестью. При исследовании способности микроорганизмов колонизировать корни прорастающих семян и влияния микроорганизмов на рост и развитие растений (за счет синтеза фитогормонов, изменения минерального и водного питания, фиксации атмосферного азота и воздействия на фитопатогены) проводят лабораторные, вегетационные и полевые опыты.
В лабораторных опытах растения выращивают в широких пробирках, цилиндрах или других флаконах, подходящих для целей эксперимента. Опыты необходимо проводить в стерильных условиях, для чего посуду стерилизуют в сухожаровых шкафах или в автоклавах. На начальных стадиях проращивания семян используют чашки Петри с влажной фильтровальной бумагой диаметром 1О см. Смачивание проводят стерильной водопроводной водой, раствором лгинеральных солей по Хогланду (см. приложение 4) или их разведением в 2 — 4 раза, а также средой культивирования или культуральной жидкостью (КЖ) изучаемых микрооргвнизмов.
В качестве субстратов можно использовать 1,5%-й водный агар или смоченные водой почву и кварцевый песок, для стерилизации которых применяют дтительный режим автоклавирования. На стерильные субстраты помещают семена или 4 — !0-дневные проростки растений, пророщенные в чашках Петри. Существует несколько способов стерилизации семян.
Чем плотнее оболочка семян, тем более жестким должен быть режим стерилизации, причем необходимо учитывать, что семена бывают заражены це только с поверхности, но и изнутри. К примеру„перед стерилизацией семена бобовых можно в течение 20 мин вьщерживать в мыльном растворе, после чего их ! ч промывают в проточной водопроводной воде. Стерилизация семян облегчается, если они предварительно набухнут в стерильной водопроводной воде. В настоящее время почти не прилгеняют стерилизацию 1%-м раствором брома (необходимо проводить в вытяжном шкафу) и сильныл~и кислотами.(соляной, серной, азотной). Наиболее популярны следующие методы: ° обработка О, ! — 0,5%-м раствором сулемы (НяС1,) в течение 2 — 5 мин; ° 96%-и или 70%-и этанолом в течение ! — 5 или 2 — 15 мин соответственно; ° 1 — 5%-м раствором гипохлорита кальция в течение 5 — 20 мин или 5 — 45%-и отбеливающим средством (ЛСЕ, Ргос!ег апг1 СагпЫе) в течение 20 мин; ° 3%-м раствором перекиси водорода в течение 5 — 20 мин; ° 5%-м хлорамином 1 — 20 мин; ° если семена заражены грибами, их протравливают 5 мин 1%-м формалином; ° применяют также комбинированную стерилизацию, например смесью перекиси водорода и этанола (1: 1), или последовательную обработку 9б%-м этанолом в течение 1 мин, а затем одним из вышеперечисленных веществ.
После стерилизации семена отмывают от 3 до 5 раз стерильной дистиллированной водой. Концентрации используемых растворов и время стерилизации могут зависеть от физиологических особенностей тест-объекта и целей эксперимента. Стерильные семена заражают изучаемыми микроорганизмами через 1 — 2 сут после прорастания семян в сосудах для проращивания или после засева в субстрат. Бактеризацию проводят с помощью суспензии бактерий в концентрации 10' — !О' кл/мл. Засеянные сосуды высгавлякп ца естественный или искусственный (люминостат с фогопериодизмом) свет.
Для предохранения корневых систем и микроорганизмов от света и перегрева прикрывают бумагой ту часть сосуда, где должна развиваться корневая система. Другой сферой использования растений в микробиологии являются биотесты. Они основаны на ростовых реакциях различных частей растений, специфически реагирующих на стимуляторы роста растений — фигогормоны, которые могут содержаться в КЖ микроорганизмов. Фитогормоны — это органические, сравнительно низкомолекулярные соединения, образующиеся в растениях в малых количествах и стимулирующие в них ростовые и формообразующие процессы.
Микроорганизмы также способны синтезировать основные из известных фитогормонов — ауксины, пигокинины, гиббереллины, этилен, абсцизовую кислоту и некоторые друтие фитогормонподобные вещества. В этом разделе рассматриваются несколько способов определения биологически активных ауксипов, гиббереллинов и цитокининов, содержащихся в культуральпой жидкости микроорганизмов. Однако для получения более полной информации о механизмах действия, структуре, функциях и методах определения активности фитогормонов необходимо обращаться к специальной литературе по физиологии растений. Определение влияния ауксинов на рост отрезков колеоптилей злаков Для проведения этого биатеста используют колеоптили злаков в фазе растяжения, но не в фазе активного роста.
Продолжительность деления и растяжения клеток в колеоптиле различается в зависимости от условий выращивания и проведения опыта, от выбранного тест-объекта и его сортовой принадлежности. В связи с этим необходимо проведение предварительных опьпов по установлению временных границ фаз роста у изучаемых объектов, для чего измеряют длину колеоптилей в динамике, а также определяют сырую и сухую массы колеоптилей. Для биотеста отбирают семена пшеницы, кукурузы или овса, обрабатывают их 70%-м этанолом в течение 5 мин и замачивают в воде в течение 3 — 4 ч при 22 — 25 С. Набухшие семена раскладыватот в кюветы (или специальные камеры) на стекло, обернутое влажной фильтровальной бумагой, и помещают в темноту в термостат на 2б 'С.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
