А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 128
Текст из файла (страница 128)
В клубеньках можно встрстить удлинанные, а у. нскоторых форм вшвистые клетки — так называемые бактероиды. 435 Для выделения клубеиьковых бактерий пользуются следующими методами. ° Свежие клубеньки отмывают от почвы в стерильной воде. Затем в стерильных же условиях их растирают в неболыдом количестве воды, и взвесь петлей вносят в пробирки с бобовым отваром. На 2 — 4-й день 1 мл взвеси, находящейся в пробирке„подвергают разведению в 6 — 8 пробирках. Из последнего разведения с помощью шпателя производят высев на плотную среду. Колонии мелкие, чаще белые, слизистые. ° Клубеньки тщательно отмывают от почвы (для этого удобны жесткие кисточки и зубные щетки). Затем их погружают на 1 мин в этиловый спирт, далее на 5 мин в 0,1%-й водный раствор сулемы, а для удаления сулемы их вновь погружают на 1 мин в спирт. После этого клубеньки тщательно промывают стерильной водой, переносят в чашку Петри или в баночку с небольшим количеством (1 — 1,5 мл) воды.
Для стерилизации клубецьков удобен тигель едуча с пористым дном, который прокаленным пинцетом последовательно переносят в болыпие закрытые чашки Петри или в тигли со стерилизующими растворами. Промывают клубеньки над колбой Бунзена 0,5 — 0,7 л стерильной воды и быстро переносят в маленькую стерильную баночку или пузырек из-под пенициллина. Клубенек раздавливают пинцетом и взвесь бактерий вносят в охлажденный до 40'С 5%-й отвар белой фасоли или бобов, содержащий 2 % сахарозы; 0,1 % КзНРО4', 0,03 % М880х 7НзО; 1% красителя коню в разведении 1: 400 и 1,5% агара, перемешивают и вливают в чашку Петри.
Можно заражать поверхность питательного агара, растирая взвесь бактерий одним и тем же шпателем последовательно в 3 чашках. Особенно аккуратно надо проводить выделение долгорастущих форм, какими, например, являются клубеньковые бактерии люпина, обнаруживающиеся лишь через 6 — 9 дней после посева.
Из большинства клубеньков клетки прорастают на 3 — 5-й день. ° При выделении клубеньковых бактерий из почвы пользуются и другим методом. Из почвы делают взвесь в стерильной воде в соотношении 1: 1000. У капилляра пипетки Пастера с питательной средой (маннит — 20,0 г; К2НРО„; М88О„' МаС! — по 0,2 г; К,БО4 — 0,1 г; СаСО, — 5,0 г; кристаллический фиолетовый — 0,01 г; воды 1000 мл) отламывают стерильно кончик и опускают его на 2 ч в почвенную взвесь.
Клубеньковые бактерии под действием хемотаксиса проникают в капилляр. Затем содержимое капилляров переносят в агаризованную среду того же состава, где через 2 — 3 дня разовьются колонии клубеньковых бактерий, в частности ЯЬ!еайит. Клубеньковые бактерии обладают избирательностью по отношению к растению-хозяину. Из 16 групп клубеньковых бактерий назовем основные группы (по растениям-хозяевам): 1) гороха, вики, чечевицы, чины, русских бобов; 2) клевера красного, белого, пунцового; 3) люцерны, донника; 4) фасоли; 5) люпина, сераделлы; 6) сои; 7) коровьего гороха, арахиса; 8) нута; 9) эспарцета; 10) маша.
Бактерии этих групп отличаются друг от друга и рядом морфофизиологических культуральных признаков (см. определители). Для накопления клубеиьковых бактерий можно воспользоваться одной из следующих сред: ° К2НРО, — 0,5 г; М880д. 7Н20 и ИаС! — по 0,2 г; СаБО4 — 0,1 г; дрожжевая вода — !00 мл (10 г дрожжей выдерживают 2 суг в 100 мл воды при 37 С); маннит — 10 г; МпБО4 — 0,005 г; (ХН4)6Мо,Ом — 0,002 г в 1000 мл воды. 436 ° Клубеньковые бактерии хорошо развиваются и в условиях глубинного культивирования с аэрацией на различных средах из семян или сена бобовых и на средах с дрожжевым отваром при температуре 24 — 2б "С.
Исходный титр при посеве — не менее 1 млн на 1 мл засеваемой среды. Уже через 24 ч титр культуральной жидкости для быстрорастущих форм достигает 8 10з — 2. 1Ою клеток. У медленно размножающихся (люции) через 2 сут титр увеличивается примерно до 4-10" кл. Выделенными бактериями можно заразить семена соответствующих бобовых растений и затем наблюдать за образованием и развитием на них клубеньков, а также за развитием самого бобового растения. Для этого поступают следуюшим образом. В высокие колбы или цилинлры наливают среду: М830 0,1%; КзНР04 — О,! %; Саз(РО4)з — 0,002 %; ГсВОх — следы; агар — 0,8 — 1,0 %.
Агар наливают в колбу слоем в 1 см, а цилиндры заполняют наполовину. Посев проволят стерильными семенами, так как с не стерильными семенами в среду могут попасть другие микроорганизмы, в том числе и клубеньковые с места репродукции семян. Для этого семена тщательно моют, затем на 3 — 4 с погружают в спирт, палее на 10 мин в 0,1 %-й раствор сулемы. При отсутствии сулемы можно просгерилизовать семена 1 %-м бромом в течение ! 5 мин, после чего семена слсдуст тщательно промыть стерильной полой.
В стерильную среду асептически вносят клубеньковые бактерии данного вида растения или почвенную взвесь в соответствующем разведении. Приготовленные таким образом колбы с семенами закрывают ватными пробками и помещают в хорошо освещаемое место с искусственным или естественным освещением. В том случае, если испытуемые бактерии были активны, через 2 — 4 недели на корнях растений появятся видимые невооруженным глазом клубеньки.
При контроле корневых волосков под микроскопом образование клубсньков можно выявить и раньше, на 8 — ! 2-й день. Если ввести в несколько сосудов почвенную взвесь в различных развслениях, то по образованию клубеньков можно сделать заключение о присутствяи в исслслуемых взвссях клубеньковых бактерий (метол прелельных разведений). Зтим метолом пользуются для количественного учета клубепьковых бактерий в почве.
При изучении развития клубепьков у клевера выяснилось, что на 3 — 4-й день развития на корнях красного клевера появлякпся корневые волоски, вокруг которых можно заметить скопления бактерий. Отмыв корни с помощью мягкой кисточки, их опускают на 30 — 40 с в 1%-й раствор мстиленовой сини и затем отмывают в воде до тех пор„ пока протоплазма корневглх волосков не обесцветится.
После этого в корневых волосках можно заметить окрашенные мелкие короткие палочки бактерий. Со старением культур клубеньковых бактерий появляются бактероиды, форма которых характерна для кюхдого вида бактерий; у гороха, чины, вики — ветвистые, у клевера — часто шарообразные, у серадсллы, фасоли, люпина — мало отличающиеся от обычных палочек. Даже в пределах вида в зависимости от условий форма бактероидов может меняться. Бактеронлы усиленно образуются при добавлении к срелс солей органических кислот: янтарной — 0,5 г пэ 1 л среды, а также винной и яблочной в количестве 1 г/л.
Для получения бакзсроидов в питагсльныс среды добавляют фосфорнокислые соли, сернокнслый магний, питраты, вытяжки из бобовых растений. Все эти изменения клубеньковых бактерий можно проследить при микроскопированяи в линамякс развития культур и бактероялной ткани клубсньков. Соли азота и навоз задерживают развитие клубеньков у расгеняя: нитраты — при концентрация 1: 10 000, амыонийные соли — при концентрации 1: 2000.
Поэтому при посевах растений вносят солей азота не более !0% от нормы, т.е, столько, сколько необходимо на первые 20 дней, до развития клубеиьков. К органическому азоту клу- беньковые бактерии менее чувствительны, а почвенный гумус стимулируег их развитие и образование клубеньков. Для развития хлубеньковых бактерий, а также для образования клубеньков у растений необходимы фосфаты, соли калия и кальция. При отсутствии в среде бора и молибдена клубенькя не образуются — бактерии вырождаются. Оптимальные концентрации этих элементов — 0,5 — 1,0 мг на 1 кг среды. Клубеньковые бактерии развиваются в пределах 6 — 36'С, оптимальной для них является температура 20 — 28 'С, погибают они при 60 — 70 'С.
Легко переносят низкие темперазуры: -15'...— !9'С. Границы рН широкие: развитие в среднем происхолит в пределах 4,3 — 11,0, оптимум рН около 7. При плохом доступе воздуха клубеньки образуются плохо и фиксация азота ничтожна. Для клубеньковых бактерий оптимальная влажность составляет 60 — 80 % от полной влагоемкости почвы. Вирулсн пюсть и активность хлубеньковых бактерий тесно связана с развитием растения. Наиболее активны клубеньки, выделенные в фазы бутонизации и пветения.
Клубеньки образуются только на свету. При недостатке освещения активные расы клубеньковых бактерий, находящиеся в уже развившихся клубеньках, приобретают паразитические свойства: недостаток углеводов заставляет их разрушать протоплазму клеток растения-хозяина. Клубеньковые бактерии в почве остаются в активном состоянии от 3 до 15 лет. Для выделения свободиоживущих аэробиых азотфиксаторов используют среды Эшби и Федорова в модигЬикоции Калининской (состав см.
в приложении 4) Для получения накопительной культуры диазотрофов агаризованную среду разливают в стерьпьные чашки Петри и дают остыть на горизонтальной поверхности. Затем, пользуясь стеклянным капилляром, смоченным в воде, рвскладывают на поверхность среды в чашке (по трафарету) 15 — 25 комочков почвы величиной с булввочную головку. Вместо агвра в качестве уплотнителя среды можно также использовать силикагель. В этом случае готовят концентрированную среду Эшби, концентрацию всех соединений в которой увеличивают в 10 раз. На поверхность чашки наносят 2 — 3 мл этой среды и подсушивают в сушильном шкафу (10 — 15 мин при 60'С). Затем, как описано выше, раскладгявают комочки почвы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
